周慧敏，劉 琛，郭宇星,*，潘道東,，曾小群，孫楊贏

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

?

固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白生產(chǎn)ACE抑制肽的條件優(yōu)化

周慧敏1，劉 琛1，郭宇星1,*，潘道東1,2，曾小群2，孫楊贏2

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

摘 要：以乳清濃縮蛋白WPC-80為原料，研究固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解WPC-80生產(chǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE）抑制肽的工藝條件。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面方法研究了酶解溫度、酶解pH值、底物與酶質(zhì)量比（[S]/[E]）、酶解時(shí)間對(duì)固定化瑞士乳桿菌蛋白酶制備ACE抑制肽的影響，確定了酶解乳清蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝條件為：溫度37 ℃、pH 7.5、[S]/[E]＝15%、酶解時(shí)間8 h。在此條件下，酶解產(chǎn)物的水解度為（6.05±0.36）%，ACE抑制率為（59.54±0.61）%。

關(guān)鍵詞：ACE抑制肽；固定化瑞士乳桿菌蛋白酶；乳清蛋白；響應(yīng)面法

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinⅠ-converting nzyme，ACE）作為一種外肽酶，它可以使血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒苁湛s調(diào)節(jié)活性的血管緊張素Ⅱ，并水解緩激肽（有血管舒張作用），使其失去活性，通過(guò)這兩個(gè)作用，ACE可使得人體血壓升高[1-3]。ACE抑制肽則可以抑制ACE的活性，達(dá)到抗血壓升高的作用。ACE抑制肽的制備方法主要包括酶解法、化學(xué)合成法、自溶產(chǎn)物提取法及DNA重組法。據(jù)調(diào)查，目前大多數(shù)高血壓患者使用合成ACE抑制劑如卡托普斯等藥物來(lái)治療高血壓，但這類合成藥物會(huì)引起咳嗽、喪失味覺(jué)及血管神經(jīng)性水腫等副作用[4-6]。而酶解制備ACE抑制肽的方法專一性較強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，易于控制以及副產(chǎn)品少，不會(huì)產(chǎn)生毒性方面的問(wèn)題。目前采用的酶包括胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶等[7-8]。據(jù)報(bào)道，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）蛋白酶活性較強(qiáng)，能特異性水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽[2]。但在研究中發(fā)現(xiàn)，瑞士乳桿菌蛋白酶獲得較困難且不能重復(fù)利用，不易實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽的規(guī)模化制備。因此，本實(shí)驗(yàn)用固定化瑞士乳桿菌蛋白酶水解乳蛋白制備ACE抑制肽，固定化酶可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用，減少生產(chǎn)成本。

本研究通過(guò)單因素酶解條件的研究和響應(yīng)面分析，優(yōu)化固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白生產(chǎn)ACE抑制肽的工藝條件，旨在為ACE抑制肽的規(guī)模生產(chǎn)及制備提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）JCM 1004南京師范大學(xué)國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)乳制品專業(yè)分析中心保存。

MRS液體培養(yǎng)基、考馬斯亮藍(lán)G-250 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；WPC-80乳清濃縮蛋白粉 北京潤(rùn)發(fā)商貿(mào)有限公司；海藻酸鈉、氯化鈣、戊二醇 南京金慶祥貿(mào)易有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE）、Hippuryl-L-histidyl-L-leucine （HHL）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES） 美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

JY92-II超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療儀器廠；CJ-2S超凈工作臺(tái) 上海上凈凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；754紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；CL-22M高速冷凍離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1 瑞士乳桿菌蛋白酶的制備

瑞士乳桿菌活化[9]：取瑞士乳桿菌JCM 1004凍干粉接種于MRS液體培養(yǎng)基，連續(xù)活化3 代，制成種子液。按體積分?jǐn)?shù)3%接種量，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期取出，收集菌體，用pH 7.1（50 mmol/L）的Tris-HCl緩沖液洗滌菌體后備用。洗滌后菌體在功率300 W，破碎時(shí)間為3 s，間隔時(shí)間為5 s的超聲波破碎條件下破碎200 次提取瑞士乳桿菌蛋白酶[10-11]。

1.3.2 瑞士乳桿菌蛋白酶含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法[12]測(cè)定。

1.3.3 海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌蛋白酶

參考文獻(xiàn)按[13-15]方法進(jìn)行。在30 mL瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入0.6 g海藻酸鈉，37 ℃水浴攪拌混勻。用10 mL注射器吸取混合液，以15 cm左右高度滴入0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4 ℃條件下靜置4 h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4 g/100 mL的戊二醛溶液交聯(lián)6 h，洗滌瀝干，得到固定化蛋白酶。實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌操作條件下進(jìn)行。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶通過(guò)蒸餾水洗滌瀝干可以重復(fù)利用。 按[16]方法進(jìn)行。稱取固定化瑞士乳桿菌蛋白酶小球1 g，加入濃度為16.4 mmol/L MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA（MS-Arg）0.05 mL，Tris-HCl（pH 7.8）緩沖液2.95 mL。混合均勻后，在37 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)2 h，以蒸餾水作為對(duì)照，取上清液在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶活力定義為37 ℃時(shí)，每小時(shí)吸光度上升0.01為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.4 固定化酶活力的測(cè)定

1.3.5 乳清蛋白的酶解及水解度計(jì)算

乳清蛋白的酶解按參考文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行。WPC-80乳清濃縮蛋白粉用蒸餾水配制成6 g/100 mL質(zhì)量濃度，65 ℃恒溫預(yù)孵15 min，使其充分溶解，用NaOH和HCl溶液調(diào)至實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)的pH值，降至實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)的溫度，然后加入固定化瑞士乳桿菌蛋白酶進(jìn)行酶解。每隔一定時(shí)間加入NaOH（0.1 mol/L）用以維持酶解pH值，記錄滴加的NaOH量，可計(jì)算水解度。酶解結(jié)束后進(jìn)行滅酶（90 ℃，20 min），離心（4 500 r/min，20 min）取上清液測(cè)定多肽的ACE抑制活性。

乳清蛋白水解度的測(cè)定采用pH-Stat法[17]。

式中：V為消耗的NaOH體積/mL；c為NaOH的濃度/（mol/L）；α為α-氨基的平均解離度，在pH值為7.0和50 ℃的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)乳清濃縮蛋白而言，α為0.44；m為蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，對(duì)于乳清濃縮蛋白而言，該值為8.8 mmol/g。

1.3.6 酶解產(chǎn)物ACE抑制活性測(cè)定

采用Cushman等[18]的方法適當(dāng)修改。取200 μL的5 mmol/L HHL溶液（6.7 mmol/L HHL，50 mmol/L HEPES，300 mmol/L NaCl，定容至50 mL，調(diào)pH值至 8.3）和 100 μL待測(cè)樣品，37 ℃條件下保溫3 min，然后加入20 μL ACE 溶液（0.1 U/mL），混勻后37 ℃保溫60 min，加入250 μL HCl（1.0 mol/L）終止反應(yīng)，然后加入1.7 mL醋酸乙酯，15 s旋渦混勻，離心（4 000 r/min，15 min）后取1.0 mL的醋酸乙酯層，于烘箱中30 min蒸干，再將其溶于1 mL去離子水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度（A228 nm）。

式中：A為加待測(cè)樣品，ACE和HHL反應(yīng)的吸光度；A0為不加待測(cè)樣品，ACE和HHL反應(yīng)的吸光度。

1.3.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

單因素酶解條件選擇酶解溫度、酶解pH值、底物與酶質(zhì)量比（[S]/[E]）、酶解時(shí)間4 個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定水平，按Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用Minitab16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白單因素條件研究

2.1.1 酶解溫度的影響

圖1　酶解溫度對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響Fig.1 Effect of temperature on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of hydrolysate

將酶解溫度設(shè)置為25、31、37、43、49 ℃，其他酶解條件設(shè)置為pH 7.5，[S]/[E]＝15%，底物質(zhì)量濃度6 g/100 mL，酶解時(shí)間8 h，考察酶解溫度對(duì)固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白水解度和酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響，結(jié)果見圖1。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶在酶解溫度為35～40℃時(shí)酶反應(yīng)效果較好。在37 ℃時(shí)乳清蛋白水解度和酶解產(chǎn)物的ACE抑制率都最高，37 ℃為固定化瑞士乳桿菌蛋白酶最適反應(yīng)溫度；37 ℃之后，溫度逐漸超過(guò)酶的最適反應(yīng)溫度，酶的活性開始減弱。在本實(shí)驗(yàn)中，固定的瑞士乳桿菌蛋白酶的酶活力為（3.80±0.16） U/mg，并且該固定化蛋白酶可以重復(fù)使用。由于海藻酸鈉載體的保護(hù)，固定的酶不像游離酶那樣驟然失活，而是緩慢減弱活性[19]。

2.1.2 酶解pH值的影響

圖2　酶解pH值對(duì)水解度和ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity

酶解pH值設(shè)定5 個(gè)條件，分別為pH 5.5、6.5、7.5、8.5和9.5，其他酶解條件設(shè)置為溫度37 ℃、[S]/[E]＝15%、底物質(zhì)量濃度6 g/100 mL、酶解時(shí)間8 h，考察酶解pH值對(duì)固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的水解度和酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響，結(jié)果見圖2。在pH值為7.5時(shí)，固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的水解度和酶解產(chǎn)物的ACE抑制率最高，當(dāng)pH值進(jìn)一步升高，水解度和酶解產(chǎn)物的ACE抑制率明顯下降。這說(shuō)明固定化瑞士乳桿菌蛋白酶的最適酶解pH值為7.5。酶的最適酶解pH值會(huì)受各種因素的影響，pH值對(duì)酶活力產(chǎn)生的影響主要原因是pH值會(huì)影響酶分子和底物的帶電狀態(tài)，從而進(jìn)一步影響了酶與底物的結(jié)合[20-21]。

2.1.3 [S]/[E]的影響

圖 33 [[S]]//[[E]對(duì)水解度和ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of [S]/[E]ratio on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity

[S]/[E]設(shè)置為5%、10%、15%、20%、25% 5 個(gè)條件，其他條件設(shè)置為溫度37 ℃、酶解pH 7.5、底物質(zhì)量濃度6 g/100 mL，酶解時(shí)間8 h，考察[S]/[E]對(duì)固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白水解度和酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響，結(jié)果見圖3。[S]/[E]達(dá)到15%時(shí)，水解度最高，酶解產(chǎn)物ACE抑制率最大，隨著[S]/[E]進(jìn)一步增加，水解度和ACE抑制率都有不同程度的下降，這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜锱c酶質(zhì)量比較高時(shí)，底物過(guò)剩使得酶與底物結(jié)合的機(jī)率降低，產(chǎn)物對(duì)ACE抑制率下降[22-23]。

2.1.4 酶解時(shí)間的影響

固定酶解溫度37 ℃、酶解pH 7.5、[S]/[E]為15%，底物質(zhì)量濃度為6 g/100 mL，觀察酶解時(shí)間0～12 h的水解度和酶解產(chǎn)物ACE抑制活性，考察酶解時(shí)間對(duì)固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白水解度和酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響，結(jié)果見圖4。在前8 h內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度和ACE抑制率都呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)樵诿附忾_始時(shí)，底物乳清蛋白較多，但隨著酶解過(guò)程的進(jìn)行，乳清蛋白越來(lái)越少，當(dāng)8 h時(shí)乳清蛋白的酶解幾乎完成，此后水解度增加趨勢(shì)減緩，而ACE抑制率卻有明顯的下降，這一結(jié)果與Mullally等[1]報(bào)道的結(jié)果相類似，長(zhǎng)時(shí)間的酶解會(huì)使ACE抑制肽酶解成氨基酸，由此減弱了產(chǎn)物的ACE抑制活性。因此綜合考慮，8 h為合適的酶解時(shí)間。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)水解度和ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity

單因素酶解條件的研究發(fā)現(xiàn)，酶解溫度、酶解pH值、[S]/[E]、酶解時(shí)間都影響固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的酶解程度。其中，酶解時(shí)間對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性的產(chǎn)生很有規(guī)律，隨著酶解的進(jìn)行，水解度和酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性逐漸升高而后維持在穩(wěn)定狀態(tài)。然而，酶解溫度、酶解pH值、[S]/[E]對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性的影響有不確定性，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用酶解溫度、酶解pH值、[S]/[E]3 個(gè)因素，進(jìn)行響應(yīng)面分析來(lái)優(yōu)化酶解條件。

2.2固定化瑞士瑞桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白制備ACE抑制肽的響應(yīng)面分析

以酶解溫度（A）、酶解pH值（B）及[S]/[E]（C）為變量，水解度和ACE抑制率為響應(yīng)值。試驗(yàn)結(jié)果見表1、回歸系數(shù)見表2、方差分析見表3。

采用Minitab 16.0對(duì)表1結(jié)果進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合，得到響應(yīng)變量乳清蛋白酶解產(chǎn)物ACE抑制率（Y）的編碼二次多項(xiàng)式擬合方程的預(yù)測(cè)模型方程：

Y=59.430 0－0.893 7A－0.606 2B＋0.365 0C－0.070 0AB－0.017 5AC＋0.032 5BC－15.225 0A2－10.135 0B2－6.157 5C2（3）

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 1 experimental design and results of response surface methodology

表3　酶解產(chǎn)物ACE抑制活性結(jié)果的方差分析TTaa bbllee 33 ANOVA for AACE inhibitory activity of whey protein hydrolysate

表2為模型方程的回歸系數(shù)表，其中因素A、B、C 對(duì)ACE抑制活性的影響都是極顯著的。方程的二次項(xiàng)影響也是極顯著的（P＜0.01），交互項(xiàng)影響一般（P＞0.05），說(shuō)明響應(yīng)值的變化較復(fù)雜。從表2的回歸系數(shù)表中可以看出，水解度的調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2=99.90%，表3中失擬項(xiàng)P=0.067＞0.05，說(shuō)明二次多

Adj項(xiàng)式回歸模型正確，回歸效果較好。

圖5　各變量交互作用對(duì)ACE抑制活性的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of three variables on ACE inhibitory activity

圖5為各相應(yīng)變量的響應(yīng)面曲面和等高線圖。各變量的交互作用對(duì)ACE抑制活性的影響較復(fù)雜。各個(gè)具體的試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系[24]。由圖5a可知，當(dāng)溫度一定時(shí)，在pH 7.0～8.0和[S]/[E]為15%左右時(shí)，ACE的抑制率較高，由圖5b可知，當(dāng)pH值一定時(shí)，ACE抑制率較好的值落在溫度37 ℃左右和[S]/[E]在15%左右的范圍內(nèi)；由圖5c可知，當(dāng)?shù)孜锱c酶的質(zhì)量比一定時(shí)，ACE抑制率較好的值落在pH 7.0～8.0和溫度37 ℃的范圍內(nèi)，其中任何兩個(gè)因素的改變都會(huì)引起抑制率的降低。采用Minitab 16.0軟件進(jìn)行分析，可以求得最佳的酶解條件為：溫度37 ℃、pH 7.5、[S]/[E]＝15%，在此條件下，可得預(yù)測(cè)值A(chǔ)CE抑制率為59.47%。在此條件下行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最后得到酶解產(chǎn)物水解度為（6.05±0.36）%，ACE抑制率為（59.54±0.61）%，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解工藝條件參數(shù)可靠，本實(shí)驗(yàn)建立的模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。

3　結(jié) 論

通過(guò)單因素分析和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的最佳酶解條件為：酶解溫度37 ℃、pH 7.5，[S]/[E]＝15%，乳清蛋白底物質(zhì)量濃度6 g/100 mL，酶解時(shí)間8 h。在此條件下，理論酶解產(chǎn)物ACE抑制率達(dá)到59.47%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，酶解產(chǎn)物的水解度為（6.05±0.36）%，ACE抑制率為（59.54±0.61）%，酶解產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥后為乳白色粉末，有奶香，溶解性良好。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ACE抑制肽的制備做了相對(duì)基礎(chǔ)的研究，為其大規(guī)模投入生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，后續(xù)將開展固定化酶解-超濾耦聯(lián)技術(shù)的研究以實(shí)現(xiàn)ACE抑制肽的連續(xù)制備。

[1]MULLALLY M M, MEISEL H, FITZGERALD R J. Angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey protein[J]. International Dairy Journal, 1997, 7(5): 299-303.

[2]LECLERC P L, GAUTHIER S F, BACHELARDB H, et al. Antihypertensive activity of casein-enriched milk fermented by Lactobacillus helveticus[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(12): 995-1004.

[3]陳勝軍, 李來(lái)好, 曾名勇. 水產(chǎn)品中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的研究進(jìn)展[J]. 南方水產(chǎn), 2006, 2(5): 69-73.

[4]JUNG K, KIM I H, HAN D. Effect of medicinal plant extracts on forced swimming capacity in mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 93(10): 75-81.

[5]SUH H J, WHANG J H, BAE S H, et al. Preparation of angiotensinⅠ-converting enzyme inhibitor from corn gluten[J]. Process Biochemistry, 2003, 38(8): 1239-1244.

[6]VALENTINI H, HENTACHELL H. Angiotensin-converting enzyme inhibitors: a clinical toxicological evaluation[J]. Clin Use Germany, 1998, 1(1): 31-34.

[7]姜瞻梅, 田波, 吳剛. 酶解牛乳酪蛋白制備ACE抑制肽的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2007, 7(6): 39-43.

[8]劉政, 馬丹丹, 孔慶霞. 酶法制備活性肽的討論[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 12(4): 40-43.

[9]傅紹軍, 李微, 朱利民. 瑞士乳酸桿菌搖瓶發(fā)酵條件及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 藥物生物技術(shù), 2005, 12(6): 361-365.

[10]郭宇星, 潘道東. 瑞士乳桿菌細(xì)胞壁蛋白酶提取研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(10): 421-424.

[11]郭宇星, 潘道東. 乳酸乳球菌細(xì)胞壁蛋白酶的分離純化[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 388-391.

[12]李巧枝, 董淑麗. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 氣象出版社, 2002: 43-44.

[13]孟廣震. 固定化微生物細(xì)胞的研究與應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1977(1): 41-45.

[14]王翠翠, 郭宇星, 潘道東. 殼聚糖固定瑞士乳桿菌蛋白酶的條件研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(3): 110-115.

[15]郭宇星, 潘道東, 王翠翠, 等. 海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌條件優(yōu)化[J].食品科學(xué), 2012, 33(5): 188-192.

[16]FERNANDEZ P, PELAEZ C, MARTIN-HERNANDEZ M C. Purification and characterization of the cell wall proteinase of Lactobacillus casein subsp. casein IFPL731 isolated from raw goat’s milk cheese[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(9): 3401-3405.

[17]潘道東, 郭宇星. 瑞士乳桿菌蛋白酶水解乳清蛋白制備ACE抑制肽的條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(11): 138-143.

[18]CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1648.

[19]ROSALES-HERNONDEZ M C, MENDIETA-WEJEBE J E. Catalytic activity of acetylcholinesterase immobilized on mesoporous molecular sieves[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2007, 40(5): 444-448.

[20]LI Fengyan, YAN Jun, DING Xingxin. Immobilization of papain on cotton fabric by sol-gel method[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(7): 1692-1697.

[21]BUISSON P, PIERRE A C. Immobilization in quartz fiber felt reinforced silica aerogel improves the activity of Condida rugosa lipase in organic solvents[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 39(1): 77-82.

[22]楊曉軍, 陸劍鋒, 林琳. 酶解斑點(diǎn)叉尾鮰內(nèi)臟制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制產(chǎn)物[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(22): 237-241.

[23]CHEN Guanwen, TSAI J, PAN B S. Purification of angiotensinⅠ-converting enzyme inhibitory peptides and antihypertensive effect of milk produced by protease-facilitated lactic fermentation[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(6): 641-647.

[24]蔡麗麗, 徐鑫, 劉國(guó)艷. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化小黃魚ACE抑制肽的酶解條件[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(23): 167-171.

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Production of ACE Inhibitory Peptides from Whey Protein Using Immobilized Proteinase of Lactobacillus helveticus

ZHOU Huimin1, LIU Chen1, GUO Yuxing1,*, PAN Daodong1,2, ZENG Xiaoqun2, SUN Yangying2
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Abstract:Angiotensin Ⅰ-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from WPC (whey protein concentrate)-80 were prepared by the immobilized proteinase produced by Lactobacillus helveticus. The effects of enzymatic hydrolysis conditions including temperature, pH, substrate to enzyme ([S]/[E]) ratio and hydrolysis time on degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity were investigated using single factor method and response surface methodology. The optimum temperature, pH, [S]/[E]ratio and hydrolysis time were found to be 37 ℃, 7.5, 15% and 8 h, respectively. Under these conditions, the degree of hydrolysis was (6.05 ± 0.36)%, and the ACE inhibitory activity of the hydrolysate was (59.54 ± 0.61)%.

Key words:ACE inhibitory peptides; immobilized proteinase of Lactobacillus helveticus; whey prote in; response surface methodology

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507012

中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2015）07-0061-05

*通信作者：郭宇星（1981—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：guoyuxing1981@163.com

作者簡(jiǎn)介：周慧敏（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：873093498@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101314）；江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK2011787）；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（13KJB550013）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ12C20003）；寧波市科技局自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012A610145）

收稿日期：2014-05-25