馬漫漫，王 超，董振明

(1. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

氮6-環(huán)戊基腺苷對(duì)大鼠腎缺血再灌注腎細(xì)胞凋亡的影響

馬漫漫1，王 超1，董振明2

(1. 河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

目的 觀察氮6-環(huán)戊基腺苷(CPA)對(duì)大鼠缺血再灌注(I/R)腎細(xì)胞凋亡的影響。方法 健康SD大鼠32只隨機(jī)分成4組，每組8只。假手術(shù)組(S)組只進(jìn)行手術(shù)操作，不做其他處理；I/R組腎缺血45 min再灌注24 h；C組給予CPA 1.0 mg/kg夾閉腎動(dòng)脈前15 min腹腔注射，余操作同I/R組；CD組給予CPA 1.0 mg/kg和8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤(DPCPX)1.0 mg/kg在夾閉腎蒂前15 min腹腔注射，余操作同I/R組。所有動(dòng)物于再灌注24 h處死。腎組織制備腎臟單細(xì)胞懸液，經(jīng)碘化丙啶染色后用流式細(xì)胞分析法測(cè)定腎臟細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 I/R組、C組和CD組腎組織細(xì)胞凋亡率明顯高于S組(P均<0.05)，C組腎組織細(xì)胞凋亡率明顯低于I/R組及CD組(P均<0.05)；I/R組與CD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 CPA可抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)大鼠腎I/R損傷有一定的保護(hù)作用。

腎；再灌注損傷；氮6-環(huán)戊基腺苷；8-環(huán)戊基-1，3-二丙基黃嘌呤；細(xì)胞凋亡

外科手術(shù)中高難度的腎臟手術(shù)如腎臟移植術(shù)、腎臟切開(kāi)取石術(shù)、腎腫瘤術(shù)、腎部分切除術(shù)、血管外科的主動(dòng)脈修補(bǔ)術(shù)需要阻斷腎臟血流，血流開(kāi)放時(shí)易引起缺血再灌注(I/R)損傷。氮6-環(huán)戊基腺苷(CPA)是腺苷A1受體激動(dòng)劑，其對(duì)腦、心臟I/R有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腎I/R損傷模型，探討CPA對(duì)大鼠腎I/R損傷的保護(hù)作用，旨在為尋找治療腎I/R損傷的有效藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1主要設(shè)備及試劑 流式細(xì)胞儀(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心)，小動(dòng)物呼吸機(jī)，小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)，CPA購(gòu)自Sigma公司，美國(guó)，8-環(huán)戊基-1，3-二丙基嘌呤(CDPCPX,Sigma公司，美國(guó))，水合氯醛。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康SD雄性大鼠32只，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量250～300 g，動(dòng)物合格證號(hào)：1182430。隨機(jī)分成假手術(shù)組(S組)、I/R組、CPA預(yù)先給藥+I/R組(C組)、CPA+CDPCPX預(yù)先給藥+I/R組(CD組)，每組8只。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛0.3 g/kg麻醉后，做右頸內(nèi)靜脈穿刺置管用微量泵持續(xù)輸液用。75%乙醇消毒腹部皮膚，暴露手術(shù)區(qū)域，用無(wú)菌生理鹽水浸濕的紗布作為無(wú)菌單鋪墊術(shù)野，沿腹正中線剪開(kāi)腹部皮膚，鈍性分離肌肉，打開(kāi)腹腔，分離腎包膜，暴露腎臟，輕柔操作，仔細(xì)尋找、分離腎蒂，保護(hù)輸尿管，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉兩側(cè)腎蒂，開(kāi)始計(jì)時(shí)。肉眼觀察腎臟的顏色由暗紅色變?yōu)樽霞t色即可確認(rèn)腎血流被阻斷，造成腎臟缺血。間斷夾閉腹部切口，用鹽水紗布覆蓋。缺血45 min后，再次打開(kāi)腹腔，暴露腎臟，顯露腎蒂，松開(kāi)動(dòng)脈夾，腎由紫紅色恢復(fù)為暗紅色可確認(rèn)血流恢復(fù)，再灌注成功，同時(shí)開(kāi)始記錄再灌注時(shí)間。逐層縫合腹部正中切口，75%乙醇消毒手術(shù)切口。繼續(xù)觀察2 h，如果大鼠能夠正?；顒?dòng)說(shuō)明造模成功。術(shù)后大鼠置于鼠籠，保持24～29 ℃的環(huán)境，密切觀察大鼠生命體征，給予正常飲食，再灌注24 h即為I/R模型。剔除松開(kāi)動(dòng)脈夾5 min后腎臟未變?yōu)檎＜t色的大鼠，術(shù)中損傷大血管或者周圍組織導(dǎo)致造模不成功大鼠，術(shù)后觀察2 h不能正?；顒?dòng)大鼠。

1.4觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠，腎組織制備腎臟單細(xì)胞懸液，經(jīng)碘化丙啶(propidine iodide,PI)染色后用流式細(xì)胞分析法測(cè)定腎臟組織細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

再灌注24 h時(shí)，S組、I/R組、C組和CD組腎組織細(xì)胞凋亡率分別為(2.67±0.85)%，(15.12±1.65)%，(9.23±1.98)%和(14.17±1.42)%。腎組織細(xì)胞凋亡率I/R組、C組和CD組明顯高于S組(P均<0.05)，C組明顯低于I/R組和CD組(P均<0.05)，而I/R組與CD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組流式細(xì)胞分析法測(cè)得腎組織細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖1～4。

圖1 再灌注24 h時(shí)S組腎組織細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

腎I/R損傷是指腎缺血后,當(dāng)自主循環(huán)功能恢復(fù)、組織再灌注后，缺血性損傷仍繼續(xù)發(fā)展，進(jìn)一步發(fā)生組織水腫及持續(xù)低灌流狀態(tài)，結(jié)果使細(xì)胞繼續(xù)缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞變性和壞死，甚至發(fā)生更為嚴(yán)重的組織損傷或腎衰竭。腎臟為高灌注器官，對(duì)缺血及再灌注均敏感。目前一致認(rèn)為缺血20～40min

圖2 再灌注24 h時(shí)I/R組腎組織細(xì)胞凋亡情況

圖3 再灌注24 h時(shí)C組腎組織細(xì)胞凋亡情況

圖4 再灌注24 h時(shí)CD組腎組織細(xì)胞凋亡情況

再灌注，其損傷是可逆轉(zhuǎn)的；缺血40～60 min后再灌注，損傷則不可逆轉(zhuǎn)。故本研究采用夾閉雙側(cè)腎蒂45 min再灌注24 h制備腎臟I/R損傷模型。

當(dāng)腎組織發(fā)生急性缺血時(shí),組織細(xì)胞的氧化磷酸化過(guò)程停止，能量迅速消耗，進(jìn)一步使腎功能活動(dòng)發(fā)生障礙，Na+、K+、Ca2+等離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)受到影響，使細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+增多，細(xì)胞腫脹，功能逐漸喪失。另外腎缺血后ATP降解生成大量次黃嘌呤，再灌注恢復(fù)后，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的催化作用下生成黃嘌呤，從而產(chǎn)生大量氧自由基和羥自由基。產(chǎn)生的自由基可通過(guò)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用對(duì)腎組織造成損害，降解生物膜中的多不飽和脂肪酸，損傷細(xì)胞膜和線粒體膜的結(jié)構(gòu)和功能，造成各種細(xì)胞功能障礙，這些氧自由基及羥自由基對(duì)腎近曲小管損傷最重[1]。

本研究結(jié)果顯示，C組腎細(xì)胞凋亡率明顯低于I/R組和CD組，表明CPA可以增加組織的抗氧化能力，降低再灌注腎組織的細(xì)胞凋亡率。Saikumar等[2]在腎損傷模型中發(fā)現(xiàn),缺血能夠?qū)е乱约?xì)胞凋亡為主的細(xì)胞死亡,再灌注時(shí)由于線粒體膜通透性增加,啟動(dòng)了Caspase家族蛋白酶,引起序列DNA酶效應(yīng)，從而進(jìn)一步加重細(xì)胞凋亡[3]。

近來(lái)研究證明在心肌缺血前,應(yīng)用腺苷可縮小心肌壞死面積,促進(jìn)再灌注時(shí)心臟功能恢復(fù),減少心肌細(xì)胞損傷,這種作用可被選擇A1受體拮抗劑所阻斷[4]。在心肌缺血時(shí),應(yīng)用腺苷可促進(jìn)其功能的恢復(fù)和減少心肌細(xì)胞損傷,減少ATP分解。Zhao等[5]在犬I/R模型中應(yīng)用腺苷140 mg/(kg·min)治療,結(jié)果顯示 ,腺苷在再灌注時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)抑制凋亡蛋白Bcl-2,促進(jìn)凋亡蛋白Bax的表達(dá),同時(shí)通過(guò)減少中性粒細(xì)胞聚集,從而抑制了心肌細(xì)胞凋亡。Leesar等[6]將30例擇期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA) 患者(不穩(wěn)定型心絞痛13例,穩(wěn)定型心絞痛17例,均是左前降支或回旋支的近端狹窄，狹窄>70%)隨機(jī)分為腺苷組和鹽水對(duì)照組,腺苷以2 mg/min的速度冠脈內(nèi)注射10 min，然后行PTCA,共行3次球囊擴(kuò)張,每次擴(kuò)張持續(xù)2 min,球囊擴(kuò)張之間間隔5 min,結(jié)果表明在冠脈左前降支行PTCA術(shù)時(shí),腺苷對(duì)抗缺血造成的心肌損害十分有效,有效性甚至強(qiáng)于缺血預(yù)適應(yīng)。Heidland等[7]報(bào)道,在為患者行PTCA前冠脈內(nèi)注入腺苷20 mg,可以增強(qiáng)心肌對(duì)缺血的耐受(具體表現(xiàn)為耐受更長(zhǎng)時(shí)間的球囊擴(kuò)張、心電圖上缺血征象減輕及胸痛減輕)，并能預(yù)防缺血期間左室功能的減退。Wei等[8]將30例需行搭橋的患者分為腺苷組和對(duì)照組,每組各15例。其中腺苷組于冠脈搭橋(CABG)術(shù)前經(jīng)靜脈輸入腺苷(開(kāi)始劑量50 μg/kg,在第2分鐘加量至100 μg/(kg·min),持續(xù)7 min,總量650 μg/kg),輸注腺苷結(jié)束后3 min開(kāi)始行體外循環(huán)。結(jié)果術(shù)后腺苷組CK生成較少,心臟指數(shù)明顯改善,提示在CABG前應(yīng)用腺苷對(duì)心臟有保護(hù)作用。王陽(yáng)等[9]研究表明腺苷能夠抑制氧自由基的生成，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)心肌I/R損傷有保護(hù)作用。

目前研究認(rèn)為iNOS是腺苷受體激動(dòng)劑預(yù)處理產(chǎn)生保護(hù)作用的效應(yīng)酶[10]，以腺苷A1受體激動(dòng)劑2-氯-N6-環(huán)戊基腺苷(CCPA)預(yù)處理能觸發(fā)胞內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生與缺血預(yù)處理相同的保護(hù)效應(yīng)。Baxter等[11]根據(jù)CCPA用量分為25，50，100 μg/kg 3組,自兔耳緣靜脈注射,結(jié)果對(duì)血壓及心率影響均較小(P均<0.05)，24 h后心肌保護(hù)程度隨CCPA用量的增加而增強(qiáng)。李小鷹等[12]和戴成等[13]R-苯異丙基腺苷(PIA)預(yù)處理大鼠，結(jié)果同樣產(chǎn)生心肌保護(hù)效應(yīng),如縮小心肌梗死面積和降低缺血性心律失常的發(fā)生率。提示腺苷A1受體是保護(hù)作用的腺苷受體亞型。本研究結(jié)果表明CPA能夠減輕腎組織細(xì)胞凋亡，DPCPX可以阻斷CPA的保護(hù)作用，CPA保護(hù)作用可能是通過(guò)激動(dòng)腺苷A1受體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。CPA預(yù)先給藥可抑制腎組織細(xì)胞凋亡，防治腎臟I/R損傷，對(duì)大鼠腎I/R損傷有保護(hù)作用。

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Effect of N6-cyclopentyl adenosine on the apoptosis of renal cells in rats after kidney ischemia-reperfusion

MA Manman1, WANG Chao1, DONG Zhenming2

(1. The Central Hospital of Handan, Handan 056000, Hebei, China; 2. The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China)

Objective It is to observe the effect of N6-cyclopentyl adenosine (CPA) on the apoptosis of renal cells in rats after kidney ischemia-reperfusion(I/R). Methods 32 healthy SD rats were randomly divided into 4 groups, each group had 8 rats. Sham group (S group) was operated only without other treatment, I/R group undergone kidney ischemia for 45 min and reperfusion for 24 h, C group was given CPA 1.0 mg/kg by intraperitoneal injection 15 min before renal artery blocking, and the rest operation was the same as I/R group, CD group was given CPA 1.0 mg/kg and 8-cyclopentyl-1, 3-2-propylxanthine (DPCPX) 1.0 mg/kg by intraperitoneal injection 15 min before renal artery blocking, and the rest operation was the same as I/R group. All the animals was killed in 24 h after reperfusion. Renal tissue was taken to made renal single cell suspension, and the apoptosis rate of renal cells was detected by flow cytometer after staining by propidium iodide. Results The apoptosis rates of renal cells in I/R group, C group and CD group were significantly higher than that in S group (Pall<0.05), and the rate in C group was obviously lower than that in I/R group and CD group (P<0.05). There was no significant difference in the rate between I/R group and CD group (P>0.05). Conclusion CPA can inhibit cell apoptosis, and has some protecting effect on renal I/R injury in the rats.

kidney; reperfusion injury;8-cyclopentyl-1, 3-2-propylxanthine; 8-cyclopentyl-1, 3-2-propylxanthine; cell apoptosis

馬漫漫，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事臨床麻醉工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.04.005

R-332

A

1008-8849(2015)04-0356-03

2014-08-20