艾 娜，謝席勝，龍瓊先，王彥江，夏夢迪

(1. 瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；2. 川北醫(yī)學院第二臨床學院/南充市中心醫(yī)院，四川 南充 637000)

CD47在糖尿病大鼠模型腎損害中的作用探討

艾 娜1,2，謝席勝2，龍瓊先2，王彥江2，夏夢迪1,2

(1. 瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；2. 川北醫(yī)學院第二臨床學院/南充市中心醫(yī)院，四川 南充 637000)

目的 觀察CD47在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病(DM)大鼠模型腎臟中的表達情況，初步探討CD47與DM腎損害的關系及其作用。方法 將成年雄性SD大鼠80只隨機分為正常對照組15只和DM組65只。采用STZ 50 mg/kg單次腹腔注射建立DM大鼠模型。監(jiān)測各組大鼠空腹血糖(FBG)、尿蛋白(UP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)；分別于2，4，8周處死各組大鼠，通過糖原染色(PAS)觀察各組大鼠腎臟的病理改變，免疫組化觀察CD47在各組大鼠腎臟的分布情況；分別對UP、Cr、BUN、腎臟病理損害、CD47蛋白表達進行相關性分析。結果 PAS染色可見DM組大鼠腎小球系膜基質增生，腎小球可見分葉現(xiàn)象等典型的糖尿病腎病損傷變化。與正常對照組相比，DM組大鼠的FBG、Cr、BUN、UP水平及CD47蛋白表達均明顯增加，并且隨著DM病程的延長而繼續(xù)增加。DM組大鼠CD47的積分光密度與Cr、BUN、UP、腎小球硬化評分呈正相關。結論 持續(xù)高血糖通過誘導DM大鼠腎小球CD47的高表達，引起細胞基質增生，參與DM大鼠腎臟的損傷和腎臟病變的進展。

糖尿病腎損害；腎小球硬化；CD47；高血糖；蛋白尿

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常見的慢性并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎病的一個主要原因。CD47也被稱為整合素相關蛋白(integrin-associated protein，IAP)，在正常腎臟系膜細胞、上皮細胞、內皮細胞均有表達，參與調節(jié)基質蛋白的黏附、細胞凋亡、增殖、遷移和存活[1-2]。但其在腎臟病理生理中的具體作用還不清楚。Hafdi等[1]研究發(fā)現(xiàn)DKD患者腎組織CD47的表達均低于腫瘤患者正常腎組織的表達，而與正常人腎組織比較的研究尚少見。在DM病程不同階段，CD47在腎小球的表達變化及其與腎臟損害的關系方面的研究亦暫無報道。本研究通過免疫組化方法檢測CD47在DM大鼠不同階段腎臟中的表達及分布情況，初步探討CD47蛋白的表達及在DKD中的作用。

1 實驗資料

1.1實驗動物及材料 清潔級雄性SD大鼠80只，8周齡，體質量(220±20)g，購自川北醫(yī)學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2008-1B。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國)；三諾安穩(wěn)血糖儀以及三諾安穩(wěn)血糖試紙(長沙三諾生物公司)；尿素氨(BUN)、肌酐(Cr)檢測試劑盒(上海科華生物公司)。兔抗大鼠CD47抗體(博士德生物公司)；兔SP免疫組化染色試劑盒(北京中杉)；DAB顯色試劑盒(博士德生物公司)。Backman全自動生化分析儀。

1.2動物分組及造模 大鼠按隨機數(shù)字表分為正常對照組15只及DM組65只。造模前禁食12 h，按50 mg/kg[3]一次性腹腔注射STZ，STZ以0.1 mmol/L、pH 4.5枸櫞-枸櫞酸鈉緩沖液配制成1%的溶液，30 min內使用。正常對照組注射等量的枸櫞酸鹽緩沖液。1周后尾靜脈取血測血糖，連續(xù)3 d≥16.7 mmol/L，且尿糖()定為DM大鼠，成模率80%，未成功的予以剔除。隨機選取DM組45只成模大鼠按完全隨機方法分為DM2周組、DM4周組和DM 8周組，每組15只。

1.3生化和病理檢查 分別于成模后2周、4周、8周禁食8 h采空腹血測空腹血糖，然后處死大鼠。處死前放入代謝籠內留24 h尿液，檢測尿蛋白定量。心臟采血測定血Cr、BUN。取出腎臟固定于10%中性甲醛固定，包埋，常規(guī)切片。PAS染色后光鏡觀察腎組織病理改變。小球硬化程度以PAS染色的小球面積占該小球總面積百分比計算。半定量評分標準參考文獻[4]方法：0分為無硬化，1分為1%～25%，2分為25%～50%，3分為50%～75%，4分為75%～100%。評分標準：取PAS染色切片，400倍鏡下每片隨機選取20個正切的腎小球，計算其均值，作為該標本的腎小球硬化指數(shù)。

1.4腎組織免疫組化檢查 按照SP免疫組織化學染色試劑盒步驟進行。石蠟切片，烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓修復，滴加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。加封閉用正常山羊血清37 ℃孵育30 min，加兔抗大鼠CD47多克隆抗體(1∶200)4 ℃過夜孵育，以PBS代替一抗做替代對照，并按抗體說明設相應的陽性組織對照。加生物素標記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min。加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。每步都用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液反復沖洗。DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。細胞中存在棕黃色顆粒表示CD47的陽性著色部位。采用Image Pro Plus 6.0軟件對各組切片進行定量分析，每張切片隨機選取4個400倍高倍鏡視野，分別測定每個視野腎小管CD47陽性染色平均積分光密度值(integral optical density，IOD)。

2 結 果

2.1造模情況 DM組喂養(yǎng)過程中死亡9只，4周組死亡3只，8周組死亡6只。正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，反應靈敏，毛色光滑；DM組大鼠日漸消瘦，體毛凌亂、發(fā)黃，失去光澤，出現(xiàn)易饑、多飲、多尿表現(xiàn)，尿中泡沫增多，部分出現(xiàn)視力下降等并發(fā)癥。

2.2各組大鼠空腹血糖(FBG)、Cr、BUN、UP檢測情況 成模后各組大鼠FBG、Cr、BUN、UP均高于正常對照組(P均<0.05)。DM組不同周數(shù)組間BUN、Cr、UP比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表1。

2.3各組腎組織病理情況及評分比較 PAS染色顯示，正常對照組腎小球結構基本正常，腎小球系膜區(qū)PAS陽性物質無明顯增多，系膜細胞無明顯增生，見圖1；DM組腎小球肥大，系膜基質增多，系膜區(qū)PAS陽性物質呈不均勻紅染，部分可見成團塊狀聚積，見圖2～4。正常對照組(n=15)、DM 2周組(n=15)、DM 4周組(n=12)、DM 8周組(n=9)腎小球硬化評分分別為(0.41±0.49)分、(0.97±0.50)分、(2.63±0.72)分、(3.56±0.63)分。DM組評分均明顯高于正常對照組(P均<0.05)，DM組組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

表1 各組大鼠FBG、Cr、BUN、UP結果比較

注：①與正常對照組相比，P<0.05；②DM 2周組比較，P<0.05；③與DM 4周組比較，P<0.05。

2.4各組腎組織CD47的表達情況 正常大鼠腎組織無或少量CD47表達，見圖5；DM早期可見腎小球內CD47表達增多，到DM8周時CD47大量表達，見圖6～8。正常對照組積分光密度(IOD)值為0.947 3±0.030 1，DM 2周組為2.325 1±0.393 2，DM 4周組為3.504 1±0.437 3，DM 8周組為6.711 7±0.512 3，DM各組IOD值均明顯高于正常對照組(P均<0.05)，DM組組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

圖1 正常對照組腎組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖2 DM 2周組腎組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖3 DM 4周組腎組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖4 DM 8周組腎組織PAS染色表現(xiàn)(×400)

圖5 正常對照組腎臟CD47免疫組化染色(×400)

2.5相關性分析 CD47 IOD值與FBG(r=0.592，P<0.05)、Cr(r=0.939，P<0.05)、BUN(r=0.859，P<0.05)、UP(r=0.975，P<0.05)、腎小球硬化評分(r=0.950，P<0.05)成正相關；腎小球硬化評分與Cr(r=0.957，P<0.05)、BUN(r=0.866，P<0.05)、UP(r=0.963，P<0.05)呈正相關。

圖6 DM 2周組腎臟CD47免疫組化染色(×400)

圖7 DM 4周組腎臟CD47免疫組化染色(×400)

圖8 DM 8周組腎臟CD47免疫組化染色(×400)

3 討 論

本研究通過建立DM大鼠模型，動態(tài)觀察腎功能及腎臟病理變化以及腎臟組織CD47的表達變化情況，結果顯示成模大鼠血糖升高，且持續(xù)處于較高水平，說明造模成功，這與既往關于DM大鼠模型的研究結果一致[5]。PAS染色顯示，成模大鼠腎小球局部基質增生，隨著DM病程的延長，基質增生更明顯，DM 8周時腎小球基質重度彌漫性增生，小球呈分葉狀，部分大鼠可見典型的K-W結節(jié)，通過腎小球硬化評分也證實在DM 8周時已出現(xiàn)明顯的腎小球硬化。隨著DM病程的延長，DM組大鼠24 h尿蛋白定量不斷升高，Cr、BUN進行性升高，說明持續(xù)高血糖狀態(tài)引起大鼠腎臟損害，腎功能異常，這與文獻[6]研究結果一致。

CD47在多種細胞中廣泛表達，可參與調節(jié)細胞外基質蛋白的黏附[1]。本研究結果表明，DM組大鼠腎臟中CD47表達的IOD值明顯升高，說明持續(xù)高血糖狀態(tài)誘導了DM大鼠腎臟CD47表達增加。Hafdi等[1]的研究發(fā)現(xiàn)，與腫瘤患者正常腎組織中CD47的表達量相比，在腎小球疾病時，CD47表達是下降的，這與本結果不一致。有研究表明，CD47與自身免疫性糖尿病的發(fā)生密切相關[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)高糖可以誘導血管平滑肌細胞CD47表達增多[8]。因此，在DM導致的腎小球病變中，可能CD47的表達不同于原發(fā)性腎小球疾病。CD47在DM大鼠腎臟高表達的現(xiàn)象值得進一步探討。

本研究通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠CD47表達的IOD值與FPG、Cr、BUN、UP水平呈正相關，說明CD47在DM腎臟的表達與DM腎功能的異常直接相關。通過對DM大鼠腎小球硬化評分發(fā)現(xiàn)，隨著血糖長期、持續(xù)升高，DM腎小球硬化更加明顯。相關性分析發(fā)現(xiàn)CD47的表達與腎小球硬化呈正相關。因此，推測持續(xù)高血糖通過誘導腎臟CD47的表達，引起細胞基質增生，從而參與DM腎臟病理及功能的損害及病變的發(fā)展。但CD47通過何種分子信號機制參與糖尿病患者腎臟的損傷有待進一步的研究。

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Discussion of the effect of CD47 in the diabetic rat model of renal damage

AI Na1,2, XIE Xisheng2, LONG Qiongxian2, WANG Yanjiang2, XIA Mengdi1,2

(1. Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China; 2.The Second Clinical Medical College of Chuanbei Medical College/Nanchong Central HosPital, Nanchong 637000, Sichuan, China)

Objective It is to observe the expression of CD47 in the kidney of diabetes (DM) rat model induced by streptozotocin (STZ) and to discuss its role and the relationship with DM kidney injury. Methods A total of 80 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (n=15) and DM group(n=65). DM group were treated with an intraperitoneal injection dose (50 mg/kg) of STZ to establish the model of DM. The level of fasting blood glucose(FBG), urine protein(UP), creatinine (Cr) and blood urinary protein (BUN) were monitored in each group；the rats in each group were sacrificed at 2, 4 and 8 weeks respectively to observe the pathological changes of kidney by periodic acid-schiff stain, the expression of CD47 in the rat kidney by immunohistochemical. The correlation between UP, Cr, BUN, renal pathological damage and CD47 protein expression were analyzed. Results Periodic acid-schiff stain showed mesangial and matrix proliferation in DM rats, some typical damage characteristics of diabetic nephropathy could be found in glomerular include leaf phenomenon, K-W nodules. Compared with normal control group, FBG, UP, creatinine, urea nitrogen and the expression of CD47 was significantly increased in DM rats(P<0.05), and with the progress of DM continue to increase. The integrated optical density (IOD) of CD47 were positively correlated with Cr, BUN, UP and the grade of glomerular sclerosis. Conclusion Sustained hyperglycemia can induce the expression of CD47 in glomerulus in DM rats, cause cell matrix hyperplasia, may participate in DM rat kidney damage and the progress of kidney disease.

diabetic nephropathy; glomerular sclerosis; CD47; hyperglycemia; proteinuria

艾娜，女，碩士研究生，從事腎病內科臨床工作。

謝席勝，E-mail：xishengx@163.com

四川省衛(wèi)生廳資助項目(2009-258；130463)；四川省教育廳資助項目(12ZA059)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.02.003

R-332

A

1008-8849(2015)02-0122-04

2014-06-25