王小虎，鄧振濤，圖 雅，李澤琳，李 霄

(1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

中藥雀舌草中總黃酮提取純化工藝優(yōu)化

王小虎1，鄧振濤1，圖 雅2，李澤琳1，李 霄1

(1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

目的 建立中藥雀舌草總黃酮含量測(cè)定方法，并對(duì)其提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法 以芹菜素作為對(duì)照品，以三乙胺(TEA)為顯色劑，在波長(zhǎng)400 nm處對(duì)樣品中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，并以總黃酮含量為指標(biāo)對(duì)其提取純化工藝優(yōu)化。結(jié)果 樣品總黃酮在濃度30.56～83.14 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為：Y=0.009 1X-0.016 1，R2=0.999 7；平均回收率為100.1%，RSD為1.95%(n=6)。雀舌草總黃酮純化工藝為采用AB-8型大孔吸附樹脂，上樣濃度為0.25 g/mL生藥材，上樣流速為3 mL/min，徑高比為1∶9，90%乙醇洗脫7倍量。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于雀舌草中總黃酮含量控制；提取純化工藝可用于雀舌草總黃酮的富集。

雀舌草；紫外分光光度法；總黃酮；工藝優(yōu)化

中藥雀舌草為石竹科植物雀舌草的全草，味微苦、酸、甘，性涼，具有祛風(fēng)散寒、續(xù)筋接骨、活血止痛、解毒等功效，臨床用于治療傷風(fēng)感冒、風(fēng)濕骨痛、瘡瘍腫毒、跌打損傷、骨折、蛇咬傷[1]?，F(xiàn)代研究表明，雀舌草含有豐富的黃酮類化學(xué)成分[2]，鑒于黃酮類化合物具有較多的藥理活性，筆者應(yīng)用紫外分光光度法建立了雀舌草總黃酮成分含量測(cè)定分析方法，并對(duì)雀舌草總黃酮提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

UV-2550紫外分光光度儀(日本島津公司)；Millipore MilliQ 超純水制備儀(LABCONCO公司)；METTLER AG 285型電子天平(1/10萬(wàn)，瑞士梅特勒公司)；KD-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市儀器有限公司)；Rotavapor R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪BUCHI)。芹菜素對(duì)照品(批號(hào)：4YZ4-J793)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；三乙胺(TEA)，北京化工分廠，分析純；95%乙醇，北京化工分廠；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；雀舌草藥材購(gòu)于安國(guó)市興隆中藥材有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)魏勝利副教授鑒定為石竹科植物雀舌草的全草；D4020、AB-8、X-5、S-8、D3520、H103等型號(hào)大孔吸附樹脂均購(gòu)自南開(kāi)大學(xué)化工廠。

2 測(cè)定方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芹菜素對(duì)照品50 mg，置于50 mL的容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容，即得芹菜素對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備 稱取雀舌草藥材粉末(粉碎過(guò)40目篩)0.5 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，加入50%乙醇溶液50 mL，稱質(zhì)量，超聲處理60 min，冷卻至室溫，稱質(zhì)量并用50%乙醇補(bǔ)充損失質(zhì)量，混勻，靜置30 min，取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3顯色方法與檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 總黃酮類成分含量測(cè)定的顯色方法主要有NaNO2-Al(NO3)2-NaOH顯色法、AlCl3-KAc法、TEA法和直接測(cè)定法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分別考察這4種顯色方法對(duì)于測(cè)定雀舌草總黃酮的適用性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TEA法測(cè)定雀舌草總黃酮效果最好。加入TEA后，芹菜素最大吸收波長(zhǎng)由340 nm紅移到398 nm，雀舌草供試品由330 nm紅移到400 nm，故選擇400 nm作為實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)。見(jiàn)圖1及圖2。

圖1 芹菜素顯色光譜圖

圖2 雀舌草供試品溶液顯色光譜圖

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取芹菜素對(duì)照品溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL，置于10個(gè)10 mL容量瓶中加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1%TEA溶液2 mL，顯色，隨后用50%乙醇定容，搖勻，以加0.0 mL對(duì)照品溶液作為空白，在400 nm處檢測(cè)其吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。得回歸方程為Y=0.009 1X-0.016 1，R2=0.999 7；結(jié)果表明芹菜素在30.56～83.14 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 芹菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5精密度考察 取同一份雀舌草藥材供試品溶液，精密吸取2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA溶液2 mL，隨后用50%乙醇定容至刻度，搖勻，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400 nm處連續(xù)檢測(cè)其吸光度值，測(cè)得其吸光度的RSD為0.1%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性考察 取同一份雀舌草藥材供試品溶液，分別在0，5，10，20，30，60，120，180，240 min，按2.4測(cè)定方法測(cè)定，測(cè)得其吸光度的RSD為0.7%，結(jié)果表明本品在室溫條件下4 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7重復(fù)性考察 取同一批次雀舌草藥材6份，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，精密吸取供試品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1%三乙胺溶液2 mL，隨后用50%乙醇定容至刻度，搖勻，用分光光度計(jì)在波400 nm處測(cè)定其吸光度值，測(cè)得每克雀舌草藥材中平均含有總黃酮29.8 mg，其RSD為2.0%(n=6)，結(jié)果表明，測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率考察 取已知含量的雀舌草藥材粉末6份，約0.2 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，并精密加入芹菜素對(duì)照品溶液6 mL，按2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備，精密吸取供試品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA溶液2 mL，隨后用50%乙醇定容至刻度，搖勻，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定其吸光度值，計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率考察

2.9雀舌草藥材中總黃酮含量測(cè)定 取雀舌草藥材3份，按2.2項(xiàng)下供試品制備方法制備，精密吸取供試品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA液2 mL，隨后用50%乙醇定容至刻度，搖勻，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定其吸光度值。計(jì)算其總黃酮含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 藥材中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 提取工藝優(yōu)化與結(jié)果

3.1正交試驗(yàn) 采用4因素3水平正交試驗(yàn)法來(lái)設(shè)計(jì)提取工藝，主要因素為提取溶劑(A)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(B)及溶劑倍量(D)，因素水平及正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表3。

表3 提取工藝L9(34)因素水平

3.2正交試驗(yàn)結(jié)果 稱取雀舌草藥材20 g共18份，其中每2個(gè)為一組平行實(shí)驗(yàn)，加入到1 000 mL的圓底燒瓶中，水浴加熱回流，按L9(34)表3中各因素水平表進(jìn)行操作，分別制備各樣品，趁熱紗布過(guò)濾，提取液冷卻后搖勻后取樣作為樣品溶液，精密吸樣品溶液150 μL，置于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液5 mL，再加入1% TEA溶液2 mL，顯色，隨后用50%乙醇定容，搖勻，再用紫外分光光度計(jì)在400 nm下檢測(cè)吸光度，檢測(cè)雀舌草提取液中總黃酮含量，真空干燥，稱質(zhì)量，計(jì)算干膏含量和得率。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，以雀舌草總黃酮為指標(biāo)測(cè)定，提取次數(shù)對(duì)雀舌草總黃酮成分的提取量有顯著影響；由方差分析可以看出，對(duì)雀舌草總黃酮的提取量影響大小為B>D>C>A，且其最佳工藝為A2B3C3D2，即提取溶劑為50%乙醇溶液15倍量，回流提取3次，每次2h。見(jiàn)表4及表5。

表4 提取工藝L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 提取工藝正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.05(2.2)=4.26，P<0.05。

4 純化工藝優(yōu)化與結(jié)果

4.1樣品溶液的制備 稱取雀舌草藥材1kg，切段，過(guò)篩，以15倍量的50%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液并濃縮至2 000 mL，即得提取液(每1 mL相當(dāng)于藥材0.5 g)，備用；另取提取液50 mL減壓干燥，經(jīng)測(cè)定，提取液中總黃酮的含量為6.4 mg/mL，干膏中總黃酮含量為6.3%。

4.2AB-8大孔吸附樹脂純化工藝優(yōu)化 取AB-8型大孔吸附樹脂約20 g，裝入層析柱(內(nèi)徑為1.5 cm、高20 cm)中，徑高比為1∶9。另取雀舌草提取液稀釋5倍(濃度為1 mL相當(dāng)于0.1 g藥材)，取160 mL上樣，上樣流速為1.0 mL/min，分份收集流出液，前60 mL每5 mL收集1份，后100 mL每10 mL收集1份，共收集22份，按2.4項(xiàng)下雀舌草總黃酮含量測(cè)定方法測(cè)定每份泄漏液中雀舌草總黃酮量。以總黃酮泄漏量為縱坐標(biāo)，以上樣藥液體積為橫坐標(biāo)繪制泄漏曲線，見(jiàn)圖4。結(jié)果可見(jiàn)，雀舌草提取液上樣15 mL時(shí)開(kāi)始泄漏，上樣50 mL后樹脂吸附完全飽和。

圖4 總黃酮泄漏曲線

4.3藥材量與樹脂體積比例考察 取3根相同型號(hào)的層析柱(內(nèi)徑為1.5 cm、高20 cm)，按徑高比1∶9裝入AB-8型大孔樹脂，樹脂量約20 g，體積約為24 mL。根據(jù)泄漏體積分別選取15 mL、20 mL、25 mL上樣，上樣藥液濃度為0.1 g生藥/mL(濃度為1 mL相當(dāng)于0.1 g藥材)，即藥材量與樹脂體積比分別為1∶16，1∶12，1∶9.6，上樣流速均為1.0 mL/min，上樣后分別用去離子水5倍量洗脫，收集水洗液；再用70%乙醇洗脫至洗脫液近無(wú)色，收集醇洗液，回收溶劑，減壓干燥，稱質(zhì)量，按2.4項(xiàng)下雀舌草總黃酮含量測(cè)定方法檢測(cè)水洗液和醇洗液中總黃酮的量，計(jì)算總黃酮的泄漏量、泄漏率、干膏含量和洗脫率，結(jié)果藥材量與樹脂體積的最佳比例為1∶9.6，最大上樣量為25 mL。見(jiàn)表6。

4.4上樣濃度、上樣流速、徑高比考察

4.4.1正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì) 采用L9(34)不重復(fù)正交試驗(yàn)，以雀舌草總黃酮含量為指標(biāo)對(duì)上樣濃度(A)、上樣流速(B)、徑高比(C)進(jìn)行考察。正交因素水平見(jiàn)表7。

表6 藥材量與樹脂體積比例考察

4.4.2正交結(jié)果分析 取9根同一型號(hào)的層析柱(內(nèi)徑為1.5cm，高20cm)，另取雀舌草提取液，并分別稀釋成濃度為0.1，0.25，0.5 g/mL的藥液，按上樣量與樹脂體積比1∶9.6上樣吸附，并按表7中各因素水平進(jìn)行操作，用去離子水5倍量洗脫，70%乙醇6倍量洗脫，收集洗脫液，按2.4項(xiàng)下雀舌草總黃酮含量測(cè)定方法測(cè)定樹脂殘夜、水洗液、醇洗液總黃酮含量，計(jì)算洗脫率、干膏含量和得率，正交試驗(yàn)結(jié)果表明，以雀舌草總黃酮含量為指標(biāo)測(cè)定，上樣濃度對(duì)樹脂純化后雀舌草總黃酮的含量有顯著性影響；由方差分析可以看出，對(duì)雀舌草總黃酮的提取量影響因素大小為C>A>B，且其最佳工藝為A2B3C3，即上樣濃度為0.25 g/mL生藥材，上樣流速為3 mL/min，徑高比為1∶9。見(jiàn)表8和表9。

表7 純化工藝L9(34)因素水平

表8 純化工藝L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表9 純化工藝正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.1(2，2)=4.26，P<0.05。

4.5洗脫溶劑的考察 取3根相同的層析柱按照上述優(yōu)化的樹脂條件裝柱上樣后，分別用50%，70%，90%乙醇洗脫7BV，收集醇洗液，回收溶劑，減壓干燥，稱量干膏質(zhì)量，按2.4項(xiàng)下雀舌草總黃酮含量測(cè)定方法分別測(cè)定醇洗液中的總黃酮含量，計(jì)算洗脫率及干膏含量。結(jié)果為用90%乙醇洗脫7倍保留體積最好，洗脫率較高，而且干膏含量也較穩(wěn)定。見(jiàn)表10。

4.6純化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取3根相同的層析柱按照上述優(yōu)化的樹脂條件制備3批樣品，上樣液均為7 mL(每1 mL相當(dāng)于0.25 g生藥材)，分別收集醇洗液，回收溶劑，減壓干燥，稱量干膏質(zhì)量，按2.4項(xiàng)下雀舌草總黃酮含量測(cè)定方法分別測(cè)定干膏中總黃酮含量，測(cè)得純化后雀舌草干膏中總黃酮含量為56.9%，比純化前提高了9倍。

5 討 論

黃酮類化學(xué)成分是中藥及天然產(chǎn)物中最常見(jiàn)而且活性較強(qiáng)的一類化學(xué)成分，關(guān)于總黃酮的測(cè)定方法多為分光光度法和HPLC法[3-5]，以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定的文獻(xiàn)較多[6-8]。但是值得注意的是，不同的藥材、不同的黃酮結(jié)構(gòu)類型具有特殊性，不能一概以蘆丁為對(duì)照品，而是要根據(jù)測(cè)定藥材的黃酮結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行實(shí)際考察，找出合適的測(cè)定方法。本研究結(jié)果顯示，芹菜素及供試品溶液經(jīng)顯色后均在400 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，可見(jiàn)以芹菜素作為雀舌草的對(duì)照品，對(duì)其總黃酮含量測(cè)定更為準(zhǔn)確。紫外檢測(cè)法測(cè)定總黃酮準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠，成本低廉，仍為一種控制中藥質(zhì)量的重要方法。

正交試驗(yàn)表明對(duì)雀舌草總黃酮提取量的影響因素中，提取次數(shù)>提取倍量>提取時(shí)間>提取溶劑，且其最佳工藝為50%乙醇溶液15倍量，回流提取3次，每次2 h。

應(yīng)用AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)雀舌草總黃酮進(jìn)行富集，通過(guò)正交試驗(yàn)等確定其最佳純化工藝為上樣濃度為0.25 g/mL生藥材，上樣流速為3 mL/min，徑高比為1∶9，90%乙醇洗脫7倍量。

表10 洗脫溶劑濃度考察數(shù)據(jù)

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Quantification of total flavonoids in Stellaria alsine and its extraction-purification process optimization

WANG Xiaohu1, DENG Zhentao1, TU Ya2, LI Zelin1, LI Xiao1

(1.College of Life Science & Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 2. China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

Objective It is to establish UV method for the quantification of total flavoids in Stellaria alsine, and optimize its extraction and purification process. Methods UV quantification for the samples was carried out with apigenin as reference and TEA as Chromogenic agent. The detection wavelength was 400 nm. Results The calibration curve of total flavonoids was linear over the range from 30.56 to 83.14 μg/mL (R2=0.999 7), regression equation wasY=0.009 1X-0.016 1, and the average recovery was 100.1%. The relative standard deviation was 1.95%. And the AB-8 type of resins was selected by indicative constituents apigenin. The best purified technological parameter was the sample concentration was 0.25 g/mL, the absorptive flow rate was 3.0 mL/min, the ratio of diameter and height was 1∶9, and the eluant was 7 volume of 90% ethanol. Conclusion The UV method was simple, rapid, accurate and specific and suitable for quality control of total flavonoids in Stellaria alsine, and the optimization process can be used for enrichment total flavonoids from Stellaria alsine Grimm.

Stellaria alsine；total flavoids；UV spectrophotometry；process optimization

王小虎，男，在讀碩士生，主要從事中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制研究。

李霄，碩士生導(dǎo)師，E-mail：lixiao@bjut.edu.cn

北京市教委資助項(xiàng)目(JC015001201201)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.02.002

R284.3

A

1008-8849(2015)02-0118-05

2014-07-10