王行政

(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院核醫(yī)學科，重慶 402160)

?

·論 著·

白細胞介素-17誘導單核細胞分泌白細胞介素-10的初步機制研究

王行政

(重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院核醫(yī)學科，重慶 402160)

目的 探討白細胞介素-17(IL-17)誘導單核細胞分泌白細胞介素-10(IL-10)的分子機制。方法 收集該院體檢中心健康者外周血，經(jīng)淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞后，利用免疫磁珠分選技術(shù)純化CD14陽性的單核細胞，然后在體外用IL-17進行刺激培養(yǎng)，或預先加入信號通路抑制劑孵育1 h后再進行刺激培養(yǎng)，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL-10的水平。結(jié)果 CD14陽性的單核細胞經(jīng)IL-17刺激后明顯誘導IL-10的分泌(P<0.01)，且具有劑量和時間依賴性；加入核轉(zhuǎn)錄因子(NK-κB)抑制劑可明顯抑制IL-17誘導單核細胞分泌IL-10的作用(P<0.05)，但MEK1/2抑制劑、p38/MAPK抑制劑和 JNK抑制劑則無明顯抑制作用。結(jié)論 IL-17可能通過NK-κB信號途徑誘導單核細胞上調(diào)IL-10的分泌，從而發(fā)揮免疫抑制作用。

白細胞介素-17； 白細胞介素-10； NK-κB信號

Th17細胞是新近發(fā)現(xiàn)的一群以表達白細胞介素-17(IL-17)為主要特征的CD4+T細胞，在多個疾病如感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤中起著重要作用[1-2]。早期的研究主要集中于Th17細胞的分化調(diào)控及其效應分子IL-17作用于上皮細胞后的下游信號[3]。但是最近發(fā)現(xiàn)IL-17受體(IL-17R)除了表達于上皮細胞，在外周血單核細胞和組織浸潤巨噬細胞表面也組成性表達[4]，提示IL-17/IL-17R可影響單核細胞和巨噬細胞的功能。在炎癥微環(huán)境中，巨噬細胞可產(chǎn)生大量的促炎因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)等介導炎癥應答，但是為了防止導致炎癥損傷，巨噬細胞也會產(chǎn)生抗炎因子如白細胞介素-10(IL-10)等進行負向調(diào)節(jié)[5]；在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤浸潤巨噬細胞也通過產(chǎn)生大量IL-10抑制抗腫瘤免疫細胞的功能，進而促進了腫瘤的不斷進展[6]。本研究收集健康者外周血，將分離純化得到的單核細胞在體外進行培養(yǎng)，探討IL-17是否能夠誘導單核細胞分泌IL-10，并進一步闡明其作用的分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集10例本院體檢中心健康者外周血，其中男5例，女5例，年齡23～38歲。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 重組人細胞因子IL-17購自美國Peprotech公司，淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；CD14+分選試劑盒和PE標記的抗人CD14抗體購自德國美天旎生物技術(shù)公司，NF-κB 抑制劑(BAY 11-7082)、MEK1/2抑制劑(U0126)、p38/MAPK抑制劑(SB203580)和 JNK抑制劑(SP600125)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，紅細胞裂解購自北京天根生化科技有限公司，IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自北京達科為公司。

1.2.2 方法 收集健康人外周血于本院免疫細胞培養(yǎng)室，利用淋巴細胞分離液將外周血中的單個核細胞分離，然后用德國美天旎生物技術(shù)公司的分選磁鐵結(jié)合CD14+免疫磁珠分選試劑盒操作說明對單個核細胞中的CD14+單核細胞進行分選純化，分離后的細胞利用PE標記的抗人CD14抗體染色30 min后進行流式細胞儀檢測純度；按照1×105細胞/孔加入到96孔板，設(shè)置三重復孔，加入不同濃度(1、10、100 ng/mL)的重組人細胞因子IL-17進行刺激，或預先加入濃度均為10 μmol/L的信號抑制劑：NF-κB抑制劑 (BAY 11-7082)、MEK1/2抑制劑 (U0126)、p38/MAPK抑制劑 (SB203580)和 JNK抑制劑 (SP600125)作用1 h，然后換取新的培養(yǎng)基后再加入IL-17(100 ng/mL)刺激24 h，收集培養(yǎng)上清液，ELISA檢測IL-10的水平，每個實驗利用3例健康者外周血進行重復。

2 結(jié) 果

2.1 單核細胞經(jīng)IL-17刺激后培養(yǎng)上清液中IL-10水平的檢測 首先，利用免疫磁珠分選技術(shù)將CD14+的單核細胞進行分離純化，得到分選后的CD14+單核細胞純度達90%以上(圖1)，表明單核細胞可用于下一步試驗。ELISA檢測結(jié)果顯示，單核細胞經(jīng)重組細胞因子IL-17刺激后，刺激組單核細胞培養(yǎng)上清液中的IL-10水平明顯高于未刺激組單核細胞，且這種效果以劑量和時間依賴的方式增加(圖2)，表明IL-17可誘導單核細胞分泌免疫抑制性的細胞因子IL-10。

圖1 外周血單個核細胞經(jīng)CD14+免疫磁珠分選試劑盒分離純化，然后流式細胞技術(shù)染色檢測分選前后CD14+細胞占總細胞比例

注：A為不同濃度IL-17刺激單核細胞24 h后培養(yǎng)上清液中IL-10的水平；B為同一濃度的IL-17(100 ng/mL)刺激單核細胞不同時間點培養(yǎng)上清液中的IL-10水平。

圖2 IL-17刺激和未刺激單核細胞培養(yǎng)上清液中IL-10水平的比較

2.2 不同信號通路抑制劑阻斷IL-17刺激后培養(yǎng)上清液中IL-10水平的比較 基于IL-17可誘導單核細胞分泌IL-10，進一步探討其可能的信號機制。在單核細胞培養(yǎng)體系中預先加入以下終濃度均為10 μmol/L的信號通路抑制劑進行阻斷：NF-κB抑制劑 (BAY 11-7082)、MEK1/2抑制劑 (U0126)、p38/MAPK抑制劑 (SB203580)和 JNK抑制劑 (SP600125)。結(jié)果顯示，在IL-17刺激的條件下，加入NF-κB抑制劑組IL-10 的水平明顯低于未加抑制劑組(P<0.05)；而加入MEK1/2抑制劑、p38/MAPK抑制劑和 JNK抑制劑組IL-10 的水平則與未加抑制劑組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。表明IL-17刺激單核細胞分泌IL-10并不依賴MEK1/2、p38/MAPK和JNK信號通路，而是依賴于NF-κB信號途徑。

圖3 不同信號通路抑制劑對IL-17(100 ng/mL)誘導單核細胞分泌IL-10的抑制效果

3 討 論

IL-17R是傳遞Th17細胞信號的受體，主要由IL-17RA和IL-17RC以異二聚體的形式組成。Th17細胞的效應分子IL-17與IL-17R結(jié)合后，通過一系列的級聯(lián)反應可激活多個包括NF-κB、MEK1/2、p38/MAPK和JNK在內(nèi)的信號通路，進而促使基因的表達并轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白后釋放到胞外發(fā)揮作用[7-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可刺激外周單核細胞分泌大量的調(diào)節(jié)性因子IL-10，而且具有劑量和時間依賴性，表明IL-17除了誘導上皮細胞產(chǎn)生促炎因子外，還可誘導髓樣來源細胞產(chǎn)生抗炎因子，能夠有效防止炎癥應答導致的免疫損傷。但是IL-10在腫瘤中可抑制CD8+T細胞的抗腫瘤功能，提示IL-17在腫瘤中起著免疫抑制作用。此外，加入多個信號通路抑制劑檢測IL-17誘導單核細胞分泌IL-10的信號機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有NF-κB抑制劑能夠明顯抑制IL-10的分泌，而MEK1/2抑制劑、p38/MAPK抑制劑和JNK抑制劑則沒有明顯的變化，提示雖然IL-17可激活多個信號通路，但是誘導單核細胞分泌IL-10主要依賴于NF-κB信號而不依賴于MEK1/2、p38/MAPK和JNK信號。文獻[10]報道，在腫瘤中除了巨噬細胞高表達IL-10，腫瘤細胞也可大量產(chǎn)生IL-10，那么，IL-17是否能夠有效刺激腫瘤細胞分泌IL-10還有待進一步研究。

總之，IL-17可通過NF-κB信號通路誘導單核細胞分泌IL-10發(fā)揮免疫抑制作用，進一步全面闡明IL-17在不同疾病下的調(diào)節(jié)功能，將為發(fā)展針對細胞因子IL-17的免疫治療提供幫助。

[1]莊園,鄒全明.Th17:新興的輔助T細胞[J].細胞與分子免疫學雜志,2008,24(9):935-927.

[2]Zou W,Restifo NP.T(H)17 cells in tumour immunity and immunotherapy[J].Nat Rev Immunol,2010,10(4):248-256.

[3]Ishigame H,Kakuta S,Nagai T,et al.Differential roles of interleukin-17A and-17F in host defense against mucoepithelial bacterial infection and allergic responses[J].Immunity,2009,30(1):108-119.

[4]ShenF,GaffenSL.Structure-functionrelationshipsintheIL-17receptor:implicationsforsignaltransduction and therapy[J].Cytokine,2008,41(2):92-104.

[5]MacKenzie KF,Clark K,Naqvi S,et al.PGE(2) induces macrophage IL-10 production and a regulatory-like phenotype via a protein kinase A-SIK-CRTC3 pathway[J].J Immunol,2013,190(2):565-577.

[6]Liu CY,Xu JY,Shi XY,et al.M2-polarized tumor-associated macrophages promoted epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells,partially through TLR4/IL-10 signaling pathway[J].Lab Invest,2013,93(7):844-854.

[7]Gaffen SL,Jain R,Garg AV,et al.The IL-23、IL-17 immune axis:from mechanisms to therapeutic testing[J].Nat Rev Immunol,2014,14(9):585-600.

[8]Xiang T,Long H,He L,et al.Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133+ cancer stem-like cells in ovarian cancer[J].Oncogene,2015,8,34(2):165-176.

[9]Gaffen SL.Structure and signalling in the IL-17 receptor family[J].Nat Rev Immunol,2009,9(8):556-567.

[10]Li Y,Gao P,Yang J,et al.Relationship between IL-10 expression and prognosis in patients with primary breast cancer[J].Tumor Biol,2014,35(11):11533-11540.

Study on preliminary mechanism of monocytes secreting IL-10 induced by IL-17

WANGHang-zheng

(DepartmentofNuclearMedicine,AffliatedYongchuanHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China)

Objective To explore the molecular mechanism of IL-17-induced the secretion of IL-10 by monocytes.Methods The peripheral blood was collected from the healthy individuals undergoing the health physical examination in our hospital physical examination center,the mononuclear cells were isolated by ficoll density gradient centrifugation,and the CD14 positive monocytes were purified from mononuclear cells by using immunomagnetic beads.In vitro CD14 positive monocytes were stimulated by IL-17,or signal pathway inhibitors were pre-incubated for 1 h and then stimulated by IL-17,the level of IL-10 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results after IL-17 stimulation,the secretion of IL-10 by CD14 positive monocytes was significantly increased (P<0.01),which is in a dose and time dependent manner.However,IL-17-induced the secretion of IL-10 was significantly decreased while adding the NK-κB inhibitor (P<0.05),but the MEK1/2 inhibitor,p38/MAPK inhibitor and JNK inhibitor had no obvious inhibiting effect.Conclusion IL-17 could induce monocytes to secret IL-10 by the NK-κB signal pathway and thus plays the immunosuppressive effect.

IL-17; IL-10; NK-κB signal

王行政，男，本科，主管技師，主要從事免疫及電化學發(fā)光的臨床應用研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.051

A

1672-9455(2015)14-2095-02

2015-02-25

2015-03-25)