程小歡,李祖華,鄭 芳

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院臨床基因診斷中心/檢驗(yàn)科 430071)

?

·論 著·

rs1122608多態(tài)性與中國漢族人血脂水平的關(guān)聯(lián)研究

程小歡,李祖華,鄭 芳△

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院臨床基因診斷中心/檢驗(yàn)科 430071)

目的 探討rs1122608(G/T) 位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人群血脂水平的關(guān)聯(lián)性。方法 在中南醫(yī)院體檢中心收集高脂血癥患者204例作為高脂血癥組，健康者187例作為健康對照組。用全自動生化儀檢測血脂水平，采用聚合酶鏈反應(yīng)-高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(PCR-HRM)檢測rs1122608(G/T)多態(tài)性。比較高脂血癥組和健康對照組間等位基因和基因型的分布差異，同時(shí)比較不同基因型亞組之間血脂各指標(biāo)的差異。結(jié)果 高脂血癥組與健康對照組GG型、GT型和TT型頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，基因型亞組間各血脂指標(biāo)總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 rs1122608(G/T)多態(tài)性與中國漢族人群血脂水平無明顯相關(guān)性。

高脂血癥； 單核苷酸多態(tài)性； 高分辨率熔解曲線

大量研究發(fā)現(xiàn)，血液中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低是冠心病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[1-2]。目前人們已通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)了大量與血脂相關(guān)的遺傳易感位點(diǎn)[3]。但這些位點(diǎn)多在歐美白種人中發(fā)現(xiàn)與血脂相關(guān)，在亞洲人群中的驗(yàn)證還不充分。由于遺傳特征及其對表型的影響存在種族差異，因此鑒定與漢族人群血脂相關(guān)的位點(diǎn)尤為重要。rs1122608位于低密度脂蛋白受體(LDLR)基因附近的SMARCA4基因上。國外研究發(fā)現(xiàn)在歐美人群中該位點(diǎn)與LDL-C水平相關(guān)[4]。2009年在Nature Genetics上發(fā)表了一項(xiàng)早發(fā)性心肌梗死的全基因組關(guān)聯(lián)研究，其中rs1122608被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與高加索人群中早發(fā)性心肌梗死明顯關(guān)聯(lián)[5]。2010年發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與中國漢族男性心肌梗死明顯相關(guān)[6]。由此推測，該位點(diǎn)可能與中國漢族人血脂水平相關(guān)。為此，本文研究了rs1122608(G/T)的基因多態(tài)性及其與血脂水平的相關(guān)性，旨在觀察其對漢族人群血脂水平的影響，評估患高脂血癥的風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年11月至2013年7月于中南醫(yī)院體檢中心收集高脂血癥患者204例作為高脂血癥組，健康者187例作為健康對照組。根據(jù)中國成人血脂異常防治指南[7]，達(dá)到高脂血癥標(biāo)準(zhǔn)為TC≥6.22 mmol/L、LDL-C≥4.14 mmol/L、HDL-C<1.04 mmol/L、TG≥2.26 mmol/L，其中1項(xiàng)或幾項(xiàng)符合即可；健康對照組為血脂水平正常的體檢人群。所有受試對象均排除甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能減退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病腎病、腎病綜合征、腎移植術(shù)后等影響脂類代謝的疾病，排除使用影響糖脂代謝藥物者。兩組研究對象的一般臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平檢測 采集受試者空腹12 h以上靜脈血3 mL，肝素抗凝，在全自動生化分析儀(雅培全自動生化分析儀)用酶法檢測TC、LDL-C、HDL-C和TG。

1.2.2 基因組DNA制備 采集受試者靜脈血2 mL 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝，采用蛋白酶K法提取基因組DNA，通過電泳鑒定DNA提取成功，通過Nanodrop2000微量紫外分光光度儀測定提取基因組DNA的濃度和純度，終濃度為50～100 ng/μL，純度OD 260/280為1.5～2.0。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和高分辨率熔解曲線分析 根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，用LSPDS軟件設(shè)計(jì)PCR-HRM引物序列，由武漢擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。正向引物：5′-GCT CTC ATT TCG TCG TGT AAA AG-3′，反向引物：5′-TGC CCC AAC ACT GCG AG-3′。PCR-HRM反應(yīng)體系總體積10 μL，其中25 mmol/L Mg2+0.8 μL，2 mmol/L dNTPs 0.2 μL，10 pmmol/uL正、反向引物各0.5 μL，1 U/μL Taq酶1 μL，10×Buffer 1 μL，DNA模板1 μL，LC熒光1 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，10 min，然后95 ℃，20 s、56 ℃，20 s、72 ℃，30 s行50次循環(huán)，最后進(jìn)行72 ℃，10 min延伸。通過LightScanner32高分辨率熔解曲線儀掃描得到熔解曲線(LightScanner32 高分辨率熔解曲線儀由武漢大學(xué)中南醫(yī)院科研中心提供)。

1.2.4 測序驗(yàn)證 隨機(jī)選取一部分樣本進(jìn)行PCR-HRM，從中選取熔解曲線不同的樣本行普通PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物由武漢擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序確定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用PLINK和SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。用Hardy-Weinberg進(jìn)行遺傳平衡校驗(yàn)，用方差分析對兩組基因型和血脂水平進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 高脂血癥組和健康對照組的一般資料

2 結(jié) 果

2.1 PCR-HRM和測序驗(yàn)證結(jié)果 不同基因型的樣本熔解曲線見圖1(A)，對于不同熔解曲線的樣本測序驗(yàn)證的結(jié)果見圖1(B、C、D)，分別顯示的是GG、GT、TT基因型。

注：A為3種基因型樣本的熔解曲線；B為GG型基因型的測序驗(yàn)證圖，黑色箭頭指向G等位基因；C為TT型基因型的測序驗(yàn)證圖，黑色箭頭指向T等位基因；D為GT型基因型的測序驗(yàn)證圖，黑色箭頭指向GT雜合基因。

圖1 3種不同基因型樣本的擴(kuò)增熔解曲線與其對應(yīng)的測序結(jié)果圖譜

2.2 高脂血癥組和健康對照組各基因型血脂水平的比較 利用PLINK進(jìn)行Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，高脂血癥組P=0.83，健康對照組P=0.19，表明樣本來自一個隨機(jī)婚配的群體，不存在抽樣誤差。兩組年齡比較P=0.534，性別比較P=0.372，均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高脂血癥組與健康對照組等位基因和基因型的分布差異見表2。各組的各基因型之間的血脂水平比較見表3。兩組各基因型間，血脂水平之間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 高脂血癥組與健康對照組等位基因和基因型的比較[n(%)]

表3 高脂血癥組與健康對照組各基因型亞組血脂水平的比較

3 討 論

心腦血管疾病一直是威脅人類健康的重要?dú)⑹种唬难芗膊〉娘L(fēng)險(xiǎn)因素很多，其中高脂血癥是主要的一個危險(xiǎn)因子[7]。因此通過對血脂的遺傳特性研究，有望尋找降低心血管疾病的預(yù)防方案。近年來，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，通過GWAS已發(fā)現(xiàn)多個血脂關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)，在歐洲白種人群中的大量研究表明部分與血脂關(guān)聯(lián)的SNPs大都與心血管疾病的發(fā)生與進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)性[8]。在中國人群中也發(fā)現(xiàn)部分與血脂關(guān)聯(lián)的SNPs與冠心病存在相關(guān)性[9]。

本文研究的SNP位點(diǎn)rs1122608(G/T)位于LDLR附近SMARCA4 基因的30號內(nèi)含子上，SMARCA4基因距LDLR基因僅36 kb。該基因也被稱為BRG1(brm/SWI2-related gene 1)，位于19p13.2，包含36個外顯子，編碼SWI/SNF核染色質(zhì)重組復(fù)合體的一個主要催化亞單位，參與干細(xì)胞更新和分化，誘導(dǎo)譜系特異性基因程序[10]。2009年Knouff等[5]首先通過GWAS發(fā)現(xiàn)rs1122608與心肌梗死相關(guān)。該位點(diǎn)在俄羅斯人群中是心肌梗死的高風(fēng)險(xiǎn)因子，但與漢族人群的心肌梗死相關(guān)性不明顯[11]，且與歐洲白種人LDL-C和冠心病關(guān)聯(lián)[4]。在伊朗人群的研究文獻(xiàn)中也提示rs1122608 (GT或TT) 與冠心病的嚴(yán)重程度相關(guān)，與多根血管的受累的相關(guān)度更高[12]。與本課題研究幾乎同期的，關(guān)于中國漢族人群冠心病rs1122608(G/T)的病例-對照研究和meta分析報(bào)道，顯示此位點(diǎn)與漢族人群冠心病發(fā)生無明顯相關(guān)[13]，在此研究中討論了SNP與多種心血管疾病的關(guān)系。而本研究著重于SNP與高血脂尤其是LDL-C的關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)與LDL-C水平之間并無相關(guān)性，共同印證了此位點(diǎn)可能具有種族遺傳異質(zhì)性。

在對一些人種的大量研究中發(fā)現(xiàn)許多SNP位點(diǎn)與血漿中LDL-C水平和冠心病均相關(guān)。對這些相關(guān)SNP的研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)使LDL-C升高的等位基因仍然會增加使用降脂藥物治療患者患心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)，而對于未使用降脂藥物的患者此風(fēng)險(xiǎn)并未增加[14]。所以對于有這些等位基因的患者，降脂并不是唯一降低他們患心血管疾病的方法。同時(shí)也說明這些位點(diǎn)對于心血管疾病的發(fā)生機(jī)制可能還涉及與血脂無關(guān)的因素。一篇關(guān)于中國漢族人群中rs1122608基因?qū)τ谇癿RNA剪接因子SFRS3表達(dá)調(diào)節(jié)的研究發(fā)現(xiàn)，其等位基因T顯示出與總膽固醇水平降低有明顯相關(guān)性，而它也能上調(diào)SFRS3編碼的一個mRNA剪接子的表達(dá)水平，但是與BRG1/SMARCA4 或 LDLR的表達(dá)無明顯相關(guān)性[15]。本文中各等位基因亞群與各血脂指標(biāo)的關(guān)系均未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。一方面可能由于本研究樣本例數(shù)偏少，而另一方面，該文提出SFSR3表達(dá)水平的增加可能會降低白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)和分泌，從而降低動脈粥樣硬化和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。這些表明rs1122608 基因?qū)τ谛难芗膊〉陌l(fā)生產(chǎn)生的作用可能并非直接影響了血脂相關(guān)基因的表達(dá)，而是通過上調(diào)SFRS3間接對其產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)在漢族人群中rs1122608(G/T)與高血脂之間無明顯相關(guān)性，可能具有種族特異性。

[1]Lloyd J,Robert JA,Todd MB,et al.Heart disease and stroke statistics-2010 update:a report from the American Heart Association[J].CircuLation,2010，121(7):206-215.

[2]Clarke R,Jonathan R,Sarah P,et al.Cholesterol fractions and apolipoproteins as risk factors for heart disease mortality in older men[J].Arch Intern Med,2007,167(13):1373-1378.

[3]Teslovich TM,Musunuru K,Smith AV,et al.Biological,clinical and popuLation relevance of 95 loci for blood lipids[J].Nature,2010,466(7307):707-713.

[4]Kathiresan S,Willer CJ,Peloso GM,et al.Common variants at 30 loci contribute to polygenic dyslipidemia[J].Nat Genet,2009,41(1):56-65.

[5]Knouff CW,Waterworth DM,Walker MC,et al.Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants[J].Nat Genet,2009,41(3):334-341.

[6]李蕾.rs1122608、rs11206510和rs1746048多態(tài)性與漢族人心肌梗死和腦梗死的關(guān)聯(lián)研究[D].云南：云南大學(xué),2010.

[7]中國成人血脂異常防治指南制訂聯(lián)合委員會.2007年中國成人血脂異常防治指南[J].中華心血管病雜志，2007，5(35):238-240.

[8]Roberts R,Stewart AF.Genes and coronary artery disease:where are we?[J].J Am Coll Cardiol,2012,60(18):1715-1721.

[9]周莉.中國漢族人群血脂水平及冠心病的遺傳易感性研究[D].武漢：華中科技大學(xué),2011.

[10]Catia A,Alex SN,Zhu YW,et al.Tissue-specific SMARCA4 binding at active and repressed reguLatory elements during embryogenesis[J].Genome Res,2014,24(6):920-929.

[11]Wang Y,Wang L,Liu X,et al.Genetic variants associated with myocardial infarction and the risk factors in Chinese popuLation[J].Plos One,2014,279(1):86332.

[12]Jamaldini SH,Babanejad M,Mozaffari R,et al.Association of polymorphisms at LDLR locus with coronary artery disease independently from lipid profile[J].Acta Med Iran,2014，52(5):352-359.

[13]Zhang L,Fang Y,Liu P,et al.Association between PCSK9 and LDLR gene polymorphisms with coronary heart disease:Case-control study and meta-analysis[J].Clin Biochem,2013,46(9):727-732.

[14]Woestijne AP,Graaf Y,Bakker PI,et al.LDL-C-linked SNPs are associated with LDL-C and myocardial infarction despite lipid-lowering therapy in patients with established vascular disease[J].Eur J Clin Invest,2014,44(2):184-191.

[15]Xiong X,Xu C,Zhang Y,et al.BRG1 variant rs1122608 on chromosome 19p13.2 confers protection against stroke and reguLates expression of pre-mRNA-splicing factor SFRS3[J].Hum Genet，2014,133(5):499-508.

Association study between rs1122608 and lipid levels in Chinese Han population*

CHENGXiao-huan,LIZu-hua，ZHENGFang△

(CenterforGeneDiagnosis,DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China)

Objective To study the association of rs1122608 single nucleotide polymorphism (SNP) and serum lipid levels in the Han population.Methods A total of 204 hyperlipidemia cases as the hyperlipidemia group and 187 healthy people as the healthy control group were recruited for the study.Serum lipid levels were detected by automatic biochemical analyzers.The rs1122608 polymorphism was determined by polymerase chain reaction (PCR) and high-resolution melting (HRM).The genotype and allele frequency distributions were compared between the hyperlipidemia group and the healthy control group.Serum lipid levels among different genotype subgroups in the hyperlipidemia group and the healthy control were compared also.Results The differences in the genotypic and allelic frequencies between the the hyperlipidemia group and the healthy control had no statistical significance (P>0.05).And there were no significant differences in TG,TC,HDL-C and LDL-C levels among different genotype subgroups in the hyperlipidemia group and the healthy control.Conclusion The rs1122608 polymorphism is not associated with lipid levels in Chinese Han population.

hyperlipidemia; single nucleotide polymorphism; high-resolution melting

武漢大學(xué)中南醫(yī)院院內(nèi)基金(201105)。

程小歡，女，碩士，主管技師，主要從事心血管疾病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)研究?！?/p>

，E-mail：zhengfang@whu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.016

A

1672-9455(2015)14-2016-03

2015-02-28

2015-04-15)