歐陽(yáng)蓉,曾正蓮

(天門(mén)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 天門(mén) 431700)

不同乙型肝炎病毒DNA載量患者磷脂酰肌醇-4-磷酸酶的表達(dá)差異及其意義

歐陽(yáng)蓉,曾正蓮※

(天門(mén)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 天門(mén) 431700)

摘要：目的探究不同乙型肝炎病毒(HBV) DNA載量患者磷脂酰肌醇-4-磷酸酶(PI4Kα)的表達(dá)差異及其意義。方法收集2013年1月至2015年1月在天門(mén)市第一人民醫(yī)院接受治療的150例慢性乙型肝炎患者及50例同時(shí)期體檢健康人群的血清，利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測(cè)所有研究對(duì)象血清的HBV DNA載量，并根據(jù)患者血清HBV DNA載量分為高病毒載量組(HBV DNA>1×105拷貝/L)、中病毒載量組(HBV DNA 1×102~1×105拷貝/L)及低病毒載量組(HBV DNA<1×102拷貝/L)3組，各50例。另外選擇50例健康體檢者的血清作為對(duì)照組。比較4組血清HBV DNA載量，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)雙抗體夾心法對(duì)4組外周血清的PI4Kα水平進(jìn)行檢測(cè)，分析HBV DNA載量與PI4Kα表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果高、中、低病毒載量組及對(duì)照組HBV DNA載量和血清PI4Kα水平分別為(5.6±1.3)拷貝/L、(3.5±0.6)拷貝/L、(1.7±0.5)拷貝/L、(1.1±0.3)拷貝/L和(4.3±0.8) μg/L、(3.4±0.7) μg/L、(2.8±0.7) μg/L、(2.2±0.6) μg/L，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中高、中及低病毒載量組HBV DNA載量和血清PI4Kα水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，高、中病毒載量組顯著高于低病毒載量組(P<0.05)，高病毒載量組顯著高于中病毒載量組(P<0.05)。隨著血清HBV DNA載量的增加，PI4Kα水平也顯著升高，兩者呈正相關(guān)(rspan=0.732，P<0.05)。結(jié)論慢性乙型肝炎患者血清PI4Kα的水平隨著HBV DNA載量的增加而增加，兩者密切相關(guān)，提示PI4Kα對(duì)HBV DNA的復(fù)制有重要作用。

關(guān)鍵詞：慢性乙型肝炎；乙型肝炎病毒 DNA載量；磷脂酰肌醇4-磷酸酶

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的，主要以肝臟炎癥病變?yōu)橹鳎⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種疾病，主要侵犯兒童和青少年，少數(shù)患者可進(jìn)展為肝硬化或肝癌[1]。目前，慢性乙型肝炎廣泛流行于世界各國(guó)，已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的世界性疾病，也是我國(guó)流行最為廣泛、嚴(yán)重的疾病[2]。近年來(lái)，隨著社會(huì)環(huán)境質(zhì)量的下降，乙型肝炎的發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì)[3]。HBV是一種DNA病毒，只對(duì)人和猩猩具有易患性，HBV侵入人體后，需在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，其復(fù)制水平與生物活性在一定程度上可由血清HBV DNA載量來(lái)反映[4]。HBV在體內(nèi)的復(fù)制會(huì)受到宿主體內(nèi)各種因素的影響，干擾影響HBV復(fù)制的宿主因素能有效抑制HBV的復(fù)制，從而有效控制乙型肝炎的發(fā)展。研究顯示，磷脂酰肌醇-4-磷酸酶(phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha，PI4Kα)參與了丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的復(fù)制，PI4Kα的抑制劑可以明顯抑制HCV的復(fù)制[5-6]。本研究通過(guò)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescent quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)檢測(cè)血清HBV DNA載量及采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)雙抗體夾心法測(cè)定血清PI4Kα的水平，分析兩者間的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2013年1月至2015年1月在天門(mén)市第一人民醫(yī)院接受治療的150例乙型肝炎患者作為研究對(duì)象。參考2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，所有患者均為乙型肝炎患者，且均為首發(fā)病例。根據(jù)患者血清HBV DNA 載量將其平均分為高病毒載量組(HBV DNA>1×105拷貝/L)、中病毒載量組(HBV DNA 1×102~1×105拷貝/L)及低病毒載量組(HBV DNA<1×102拷貝/L)3組，各50例。高病毒載量組中男27例、女23例，年齡20～26歲，平均(23.0±1.0)歲；中病毒載量組中男26例、女24例，年齡20～26歲，平均(24.0±0.7)歲；低病毒載量組中男29例、女21例，年齡21～26歲，平均(23.0±1.0)歲。另外選擇50例健康體檢者的血清作為對(duì)照組，其中男28例、女22例，年齡20～26歲，平均(23.0±0.9)歲。4組受試者在性別、年齡等一般臨床資料方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2研究方法收集不同病毒載量組及對(duì)照組清晨空腹靜脈血6 mL，離心半徑6 cm， 3000 r/min，離心15 min，取上層血清并分裝于Eppendorf(EP)管內(nèi)，-90 ℃條件下冷凍保存。采用FQ-PCR測(cè)定以上血清HBV DNA載量，同時(shí)采用ELISA法測(cè)定所有受試者血清中PI4Kα的水平。

2結(jié)果

2.1各組受試者HBV DNA載量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后比較高、中、低病毒載量組及對(duì)照組血清HBV DNA載量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，組間兩兩比較結(jié)果顯示，高、中及低病毒載量組HBV DNA載量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，高及中病毒載量組HBV DNA載量顯著高于低病毒載量組(P<0.05)，高病毒載量組HBV DNA載量顯著高于中病毒載量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組受試者HBV DNA載量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后比較　，拷貝/L)

HBV:乙型肝炎病毒；a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與高病毒載量組比較，P<0.05；c與中病毒載量組比較，P<0.05

2.2各組受試者血清PI4Kα水平的比較高、中、低病毒載量組及對(duì)照組血清PI4Kα水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間兩兩比較結(jié)果顯示，高、中及低病毒載量組血清PI4Kα水平高于對(duì)照組(P<0.05)，高病毒載量組血清PI4Kα水平高于中病毒載量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2各組受試者血清PI4Kα水平比較

組別例數(shù)PI4Kα對(duì)照組 502.2±0.6低病毒載量組502.8±0.7abc中病毒載量組503.4±0.7ab高病毒載量組504.3±0.8aF86.260P0.000

PI4Kα：磷脂酰肌醇-4-磷酸酶；a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與高病毒載量組比較，P<0.05；c與中病毒載量組比較，P<0.05

2.3血清PI4Kα水平與HBV DNA載量的相關(guān)性分析Spearman分析結(jié)果顯示，隨著血清HBV DNA載量的增加，血清PI4Kα水平顯著升高，兩者呈正相關(guān)(rs=0.732，P<0.05)。

3討論

慢性乙型肝炎是我國(guó)常見(jiàn)的慢性傳染病之一，由HBV感染侵襲肝細(xì)胞引起，HBV侵染宿主后，使機(jī)體免疫功能低下，易被各種細(xì)菌、病毒感染，加重機(jī)體原有的疾病狀態(tài)，主要表現(xiàn)為乏力、惡心、厭食、腹脹及肝區(qū)疼痛等癥狀，有較高的傳染率，據(jù)估計(jì)，全球每3人中就會(huì)有1人感染HBV，而其中有2.4億～3.5億人會(huì)轉(zhuǎn)變成慢性乙型肝炎[8]。雖然大部分慢性肝炎患者無(wú)明顯癥狀，但仍約有25%長(zhǎng)期感染的患者進(jìn)展成為肝纖維化、肝硬化及肝癌[9]。在我國(guó)，母嬰傳播是HBV主要的傳播方式，這也是造成乙型肝炎在我國(guó)呈家族聚集特征的主要原因。近年來(lái)，有調(diào)查顯示，乙型肝炎患者發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)，估計(jì)每年因乙型肝炎死亡的人數(shù)約為75萬(wàn)人[10]。乙型肝炎患者常并發(fā)糖尿病、脂肪肝及肝炎后高膽紅素血癥等嚴(yán)重影響人們正常生活的疾病，其高致死率亦嚴(yán)重危害人民的生命與健康。目前，已有大量有關(guān)乙型肝炎治療方法的研究，并取得相應(yīng)的進(jìn)展，但乙型肝炎仍然是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題[11]，HBV DNA的持續(xù)復(fù)制是促進(jìn)肝炎轉(zhuǎn)化為肝硬化與肝癌的主要原因，而由于受其自身基因組大小的限制，其在宿主體內(nèi)的復(fù)制需結(jié)合在宿主基因組上，因而其復(fù)制的過(guò)程受到機(jī)體多種因素的調(diào)節(jié)，尋找并抑制促進(jìn)HBV DNA復(fù)制的因子，從而最大限度地抑制其復(fù)制、清除病毒，進(jìn)而穩(wěn)定患者病情是目前治療乙型肝炎的主要研究思路與方向[12]。而PI4Kα就是調(diào)節(jié)HBV DNA復(fù)制的宿主主要因子之一。

2009年國(guó)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)全基因組范圍的小干擾RNA文庫(kù)篩選的方法證實(shí)，PI4Kα是參與HCV復(fù)制的一種宿主因子，是HCV復(fù)制所必需的[13]。PI4Kα是由PI4KCα基因編碼的一種脂激酶，是人體內(nèi)4種磷脂酰肌醇-4-激酶之一，屬于磷脂酰肌醇的家族成員之一。其主要生物學(xué)作用為催化多聚磷脂酰肌醇的合成，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上囊泡的運(yùn)輸及脂質(zhì)代謝，PI4Kα主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，極少量存在于血漿膜，其在高爾基體功能中也發(fā)揮著特定的作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，在HCV感染細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程中，PI4Kα發(fā)揮著重要作用，是該過(guò)程不可缺少的宿主蛋白之一，其主要機(jī)制如下：HCV在宿主體內(nèi)主要通過(guò)調(diào)整肝細(xì)胞內(nèi)膜，促使其產(chǎn)生特定的微環(huán)境，建立特殊的復(fù)制平臺(tái)保證自身有效的復(fù)制，HCV主要以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜作為復(fù)制膜的來(lái)源，此過(guò)程主要由HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5A(non-structural protein 5A,NSSA)誘導(dǎo)產(chǎn)生，宿主體內(nèi)PI4Kα因子是復(fù)制膜組成所必須的，HCV NSSA可以激活并募集PI4Kα到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的PI4Kα水平增加，PI4Kα可以改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的曲率，產(chǎn)生高曲率的膜袋，從而保護(hù)HCV蛋白及其RNA免受宿主的攻擊破壞，同時(shí)PI4Kα的401～600位氨基酸與NSSA的結(jié)構(gòu)域Ⅰ發(fā)生相互作用，使病毒復(fù)制蛋白在細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)定位，并維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的穩(wěn)定性和完整性，最終促進(jìn)HCV的復(fù)制[14]。采用PI4Kα抑制劑后，HCV DNA的復(fù)制明顯受到抑制。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI4Kα抑制劑可以抑制PI4Kα與HCV NSSA的結(jié)合，從而抑制HCV的復(fù)制，因此PI4Kα通過(guò)與NSSA結(jié)合并促使其磷酸化，從而促進(jìn)HCV的復(fù)制，PI4Kα的活性對(duì)HCV的復(fù)制起著至關(guān)重要的作用。相關(guān)學(xué)者采用敲除野生型細(xì)胞中PI4Kα基因的方法進(jìn)行營(yíng)救窒息突變細(xì)胞的研究證實(shí)了此觀點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者HCV感染組織細(xì)胞中均檢測(cè)到PI4Kα的催化產(chǎn)物磷脂酰肌醇-4-磷酸明顯升高[15]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)PI4Kα與病毒性肝炎的研究主要側(cè)重于丙型肝炎，而PI4Kα與HBV在感染肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制是否有密切關(guān)系尚缺乏大量研究證實(shí)。

有學(xué)者研究顯示，乙型肝炎的傳播概率與受HBV感染者體內(nèi)的HBV DNA載量呈正相關(guān)，且慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA載量與其肝纖維化程度及肝組織炎癥分級(jí)亦呈正相關(guān)[16]。因此，研究如何控制HBV的復(fù)制對(duì)改進(jìn)乙型肝炎的治療方法和思路有重要意義。研究顯示，干擾PI4Kα的表達(dá)后，HBV的復(fù)制效率顯著降低[14]，說(shuō)明PI4Kα同樣參與HBV DNA在宿主體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高、中及低病毒載量組患者HBV DNA載量、PI4Kα水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Spearman分析結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎患者血清PI4Kα水平與血清HBV DNA載量呈正相關(guān)(P<0.05)，表明PI4Kα的表達(dá)與患者血清HBV DNA載量密切相關(guān)，PI4Kα因子可能參與了HBV DNA的復(fù)制，在一定程度上可提示HBV DNA在宿主體內(nèi)的復(fù)制速率。本研究結(jié)果與Mirabelli等[17]的研究結(jié)論一致。

綜上所述，PI4Kα有望成為新的治療乙型肝炎的靶標(biāo)，為控制HBV感染及治療乙型肝炎提供了全新的思路及方法。而PI4Kα參與HBV DNA復(fù)制的具體機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究，即遏制HBV傳播及治療乙型肝炎的方法有待進(jìn)一步明確及改進(jìn)。

參考文獻(xiàn)

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].中國(guó)臨床醫(yī)生,2012,40(4):66-78.

[2]Vlachogiannakos J,Papatheodoridis GV.Optimal therapy of chronic hepatitis B:how do I treat HBeAg-positive patients?[J].Liver Int,2015,35(Suppl 1):100-106.

[3]Wu H,Zhao G,Qian F,etal.Association of IL28B polymorphisms with peginterferon treatment response in Chinese Han patients with HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].Liver Int,2015,35(2):473-481.

[4]嚴(yán)穎,麥麗,鄭玉寶,等.慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA載量與肝組織病理改變的分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2012,33(4):486-489

[5]Cheng HR,Kao JH,Wu HL,etal.Clinical and virological features of occult hepatitis B in patients with HBsAg seroclearance post-treatment or spontaneously[J].Liver Int,2014,34(6):e71-79.

[6]肖寒,馬陳斌,張利霞,等.恩替卡韋對(duì)慢性乙型肝炎患者血清中HBV DNA載量與TGF-β1的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(4):589-592.

[7]Kitrinos KM,Corsa A,Liu Y,etal.No detectable resistance to tenofovir disoproxil fumarate after 6 years of therapy in patients with chronic hepatitis B[J].Hepatology,2014,59(2):434-442.

[8]李鴿,王潔,鮑艷婷,等.慢性乙型肝炎HBsAg及HBsAg/HBV DNA比值與組織病理炎癥活動(dòng)度的相關(guān)性[J].中華肝臟病雜志,2015,23(1):40-45.

[9]Bertoletti A,Ferrari C.Innate and adaptive immune responses in chronic hepatitis B virus infections:towards restoration of immune control of viral infection[J].Gut,2013,89(1051):294-304.

[10]王惠,劉伶利,盧燕,等.慢性乙型肝炎患者血清前S1抗原與HBV-DNA載量的相關(guān)性分析[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志,2014,36(12):1147-1148.

[11]Marcellin P,Gane E,Buti M,etal.Regression of cirrhosis during treatment with tenofovir disoproxil fumarate for chronic hepatitis B:a 5-year open-label follow-up study[J].Lancet,2013,381(9865):468-475.

[12]Keshvari M,Alavian SM,Sharafi H.How can we make decision for patients with chronic hepatitis B according to hepatitis B virus (HBV) DNA level?[J].Hepat Mon,2014,14(2):e15285.

[13]劉昊剛,辛永寧,姜曼,等.磷脂酰肌醇-4-激酶和磷脂酰肌醇-4-磷酸在不同病毒復(fù)制中作用的研究進(jìn)展[J/CD].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志:電子版,2014,26(5):710-714.

[14]Bojjireddy N,Botyanszki J,Hammond G,etal.Pharmacological and genetic targeting of the PI4KA enzyme reveals its important role in maintaining plasma membrane phosphatidylinositol 4-phosphate and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels[J].J Biol Chem,2014,289(9):6120-6132.

[15]Kaur H,Jajodia A,Grover S,etal.Synergistic association of PI4KA and GRM3 genetic polymorphisms with poor antipsychotic response in south Indian schizophrenia patients with low severity of illness[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2014,165B(8):635-646.

[16]Do DN.Genome-wide association and systems genetic analyses of residual feed intake,daily feed consumption,backfat and weight gain in pigs[J].Bmc Genetics,2014,15(8):1066-1072.

[17]Mirabelli C,Surdo M,Hemert FV,etal.Specific mutations in the C-terminus domain of HBV surface antigen significantly correlate with low level of serum HBV-DNA in patients with chronic HBV infection[J].J Infect,2015,70(33):288-298.

The Difference of the Expression of Phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha in Patients with Different HBV DNA Load and Its SignificanceOUYANG-Rong,ZENGZheng-lian.(DepartmentofClinicalLaboratory,TianmenCityFirstHospital,Tianmen431700,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the difference of the expression of phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha (P14Kα)in serum between patients with different hepatitis B virus(HBV) DNA loads and its significance.MethodsSerum samples were collected from 150 patients with chronic hepatitis B(CHB) and 50 healthy people in Tianmen City First Hospital during Jan.2013 and Jan.2015,whose HBV DNA loads were determined by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).According to the serum HBV DNA loads,the 150 patients were divided into three groups:high viral load group(HBV DNA load>1×105copies/L),medium viral load group(1×105copies/L≤HBV DNA≤1×102copies/L),and low viral load group(HBV DNA load<1×102copies/L),while the serum samples of 50 healthy people were selected as control group.The HBV DNA loads in serum between the four groups were compared.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the concentration of PI4Kα in peripheral serum,Spearman inspection was used to analyze the correlation between HBV DNA loads and the expression level of PI4Kα.ResultsHBV DNA load and serum PI4Kα level of high,medium and low viral load group and control group were (5.6±1.3) copies/L,(3.5±0.6) copies/L,(1.7±0.5) copies/L，(1.1±0.3) copies/L and (4.3±0.8) μg/L,(3.4±0.7) μg/L,(2.8±0.7) μg/L,(2.2±0.6) μg/L,there were significant differences between the four groups(P<0.05).Among them,HBV DNA load and serum PI4Kα level of the high and low viral load were significantly higher than that of the control group (P<0.05),and the high and medium viral load group was significantly higher than that of the low viral load group (P<0.05),high viral load group was significantly higher than that of the low viral load group (P<0.05).The HBV DNA load and PI4Kαconcentration presented a positive correlation with each other,i.e.serum PI4Kα level would be elevated with the increase in HBV DNA load(rs=0.732,P<0.05).ConclusionSerum PI4Kα level is elevated with the increase in HBV DNA load,the concentration of serum PI4Kα is closely correlated with the HBV DNA load in patients with CHB,which suggests that PI4Kα may play a crucial role in the HBV DNA replication.

Key words：Chronic hepatitis B; Hepatitis B virus DNA load; Phosphatidylinositol 4-kinase Ⅲ alpha

收稿日期：2015-04-19修回日期：2015-06-16編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.050

中圖分類(lèi)號(hào)：R575.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)17-3207-03