陳 哲， 雷明明， 于建寧， 王公金， 施振旦

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，動(dòng)物品種改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

抵抗素樣 β(Resistin-like molecule β，RELMβ)是抵抗素樣家族(Resistin-like molecules，RELMs)一員，RELMs共有 4個(gè)成員，分別是 RELMα、RELMβ、resistin和RELMγ，該家族成員在C端信號(hào)區(qū)內(nèi)含有獨(dú)特的10到11個(gè)半保守的半胱氨酸殘基，可通過(guò)二硫鍵形成低聚分子［1］。RELMs在糖尿病、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖方面都有相關(guān)作用［2］。RELMβ又稱發(fā)現(xiàn)于炎癥帶2(Found in inflammatory zone 2，F(xiàn)IZZ2)，最初是在嚙齒類和人類的胃腸道發(fā)現(xiàn)，在近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸表達(dá)量最為豐富［3］。

研究發(fā)現(xiàn)，RELMβ可由腸道杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，并作為Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)因子，參與胃腸道感染的耐受［4］。RELMβ可以通過(guò)依賴 IL-4(Interleukin 4)和IL-13的調(diào)控途徑產(chǎn)生抗寄生蟲(chóng)作用［5］，同時(shí)還可直接與寄生蟲(chóng)的化學(xué)感受部位結(jié)合，干擾寄生蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)供給，起到蠕蟲(chóng)抑制劑的作用［6］。此外，RELMβ還可以通過(guò)上調(diào)腸道先天免疫因子MUC2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平，保護(hù)腸道粘膜屏障的完整性［7］。RELMβ作為一個(gè)免疫相關(guān)的重要候選基因，對(duì)畜禽健康具有重要意義。

目前對(duì)RELMβ的功能有了較為廣泛的研究，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不十分清晰。本研究利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，對(duì)豬RELMβ基因啟動(dòng)子進(jìn)行結(jié)構(gòu)和活性分析，找到RELMβ基因啟動(dòng)子的核心調(diào)控區(qū)域，為進(jìn)一步研究豬RELMβ基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

Premix Taq 酶、T4 DNA 連接酶、DNA marker、內(nèi)切酶、瓊脂糖回收純化試劑盒、小提質(zhì)粒提取試劑盒、中提質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)有限公司，克隆所用菌株DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，pGL3-basic、pGL3-Enhancer、pRL-Tk 載體和雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，人胚腎細(xì)胞株293T、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT29購(gòu)自凱基生物(南京)，Lipo LTX、Opti-MEM、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司，引物合成及DNA測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 使用 GPMiner(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù) 測(cè)RELMβ基因 5'端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) TSS;使用 TFSEARCH 在線軟件(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)和 Genomatix MatInspector(http://www.genomatrix.de/cqi-bin)對(duì)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè);使用NCBI網(wǎng)站Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)序列分析軟件對(duì)豬、人(NCBI登錄號(hào):NT_005612)和小鼠(NCBI登錄號(hào):NT_039624)啟動(dòng)子序列進(jìn)行多重比對(duì)，比較同源性;使用Primer6.0軟件里的Motif模塊進(jìn)行TATA-box(識(shí)別序列TATAWAW，W代表A或T)、CAAT-box(識(shí)別序列 CCAAT)和 GC-box(識(shí)別序列GGGCGG)位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR 根據(jù)GenBank獲得的人RELMβ基因(登錄號(hào):NT_005612)序列以及豬RELMβ基因mRNA序列(登錄號(hào):NM_001103210)，結(jié)合引物設(shè)計(jì)原則，采用Primer 6.0軟件自行設(shè)計(jì)6對(duì)PCR引物序列(表1)，并在上下游引物引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。在0.2 ml PCR反應(yīng)管中加入 Premix Taq 12.5 μl，DNA 模板1 μl，上下游引物各1μl，無(wú)菌去離子水9.5μl。PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性3 min;98℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)36次，最后產(chǎn)物在72℃延伸10 min。

表1 擴(kuò)增RELMβ基因啟動(dòng)子片段引物Table 1 Primers designed for amplifying promoter segments of porcine RELMβgene

1.2.3 報(bào)告基因載體構(gòu)建 將PCR反應(yīng)獲得的不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段純化，經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切、凝膠回收、T4 DNA連接酶連接后，定向克隆到報(bào)告基因載體pGL3-Enhancer中，利用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切和測(cè)序方法，篩選構(gòu)建正確的重組豬RELMβ基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)胚腎293T細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 HT29，0.25%胰酶消化液消化傳代，每2 d傳代1次。

接種293T、HT29細(xì)胞于96孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率 70%～80%時(shí)，將構(gòu)建的pGLRELMβ-Enhancer系列缺失片段熒光素酶報(bào)告載體采用脂質(zhì)體Lipo LTX轉(zhuǎn)染到以上細(xì)胞內(nèi)，作為試驗(yàn)組，同時(shí)轉(zhuǎn)染 pGL3-basic為陰性對(duì)照組，pRL-TK為內(nèi)參質(zhì)粒，試驗(yàn)重復(fù)3次，每組3個(gè)平行試驗(yàn)?；蛩矔r(shí)轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine LTX試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 雙熒光素酶活性分析 轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，加入30μl細(xì)胞裂解緩沖液，室溫?fù)u晃15 min后，吹打細(xì)胞，收集裂解液至96孔白板，加入100μl熒光素酶分析劑(LARⅡ)，放置發(fā)光檢測(cè)儀Glomax(Promega)中，測(cè)定Firefly熒光素酶活性(M1)，然后再加入100μl Stop＆Glo reagent，測(cè)定內(nèi)參質(zhì)粒中Renilla熒光素酶活性(M2)，計(jì)算熒光素酶相對(duì)活性(M1/M2)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 不同缺失片段啟動(dòng)子活性值之間的比較在Excel中進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)方法使用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 豬RELMβ基因啟動(dòng)子系列缺失片段的擴(kuò)增

通過(guò)PCR分別得到1 057 bp(－842～+215)、1 008 bp(－793～ +215)、789 bp(－574～ +215)、397 bp(－182～ +215)、362 bp(－147～ +215)和301 bp(－86～+215)的啟動(dòng)子片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)顯示擴(kuò)增長(zhǎng)度符合預(yù)期，重組報(bào)告載體經(jīng)過(guò)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證，不同長(zhǎng)度RELMβ啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建成功(圖1)。

2.2 豬RELMβ基因啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析

圖1 重組RELMβ基因報(bào)告載體雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant RELMβ gene report plasmid by double enzyme digestion

對(duì)豬RELMβ基因5'端序列進(jìn)行在線生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，豬RELMβ基因啟動(dòng)子區(qū)存在1處TATA box，1 處 CAAT box，無(wú) GC box。GPMiner在線分析預(yù)測(cè)豬和人RELMβ基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在－556 bp和－487 bp處。截取豬、人(NCBI登錄號(hào):NT_005612)、小鼠(NCBI登錄號(hào):NT_039624)的RELMβ基因起始密碼子前842 bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，豬和人的同源性是34.9%，豬和小鼠的同源性是82.4%。

盡管豬和人之間RELMβ基因啟動(dòng)子序列保守性較低，結(jié)合TFSEARCH和Genomatix MatInspector預(yù)測(cè)豬RELMβ基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，比較發(fā)現(xiàn)，豬和人RELMβ基因啟動(dòng)子區(qū)還是存在許多保守的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括 Cdx2，SRY，NFKB，NKX-2，c-Myb，GATA-1，GATA-3，C/EBP，MZF等(圖2)。

2.3 豬RELMβ基因啟動(dòng)子活性分析

將構(gòu)建的 pGL-RELMβ(－842～ +215)、pGLRELMβ(－793～ +215)、pGL-RELMβ (－574～+215)、pGL-RELMβ(－182～ +215)、pGL-RELMβ(－147～+215)和 pGL-RELMβ(－86～ +215)啟動(dòng)子報(bào)告載體分別轉(zhuǎn)染至HT29和293T細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明:不同長(zhǎng)度RELMβ啟動(dòng)子在HT29和293T細(xì)胞均具有活性，且在2個(gè)細(xì)胞系中，pGL-RELMβ(－574～+215)活性均為最強(qiáng)，顯著高于其他報(bào)告質(zhì)粒的活性(P＜0.01)。從pGL-RELMβ (－574～ +215)到 pGL-RELMβ(－182～+215)的相對(duì)熒光值下降幅度最大，推測(cè)在－574～－182位點(diǎn)存在RELMβ基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵順式調(diào)控元件(圖3)。

圖2 豬和人RELMβ基因啟動(dòng)子序列比較分析Fig.2 Alignment of RELMβ gene promoter sequence of swine and human

圖3 RELMβ基因啟動(dòng)子不同片段在細(xì)胞系內(nèi)的相對(duì)熒光素酶活性Fig.3 Activities of different segments of RELMβ promoter in HT29 and 293T cells

3 討論

腸道是能量攝取和營(yíng)養(yǎng)吸收器官，也是重要的內(nèi)分泌器官，RELMβ參與腸道內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素抵抗等生理功能。RELMβ通過(guò)GLUT2表達(dá)量和活性的增強(qiáng)提高空腸內(nèi)葡萄糖的吸收［8］;小鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RELMβ基因可能是營(yíng)養(yǎng)因素誘導(dǎo)的胰島素抵抗行為的重要調(diào)節(jié)因子［9］，進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，RELMβ可能通過(guò)P38/MAPK途徑參與胰島素信號(hào)通路［10］。目前RELMβ已成為研究腸道疾患和評(píng)估肥胖型胰島素抵抗的新靶標(biāo)［10-11］。

為探討RELMβ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究通過(guò)PCR方法從豬DNA獲得RELMβ基因上游－842～+215 bp的啟動(dòng)子序列，進(jìn)而構(gòu)建了不同長(zhǎng)度的RELMβ啟動(dòng)子重組報(bào)告質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)－574～+215 bp活性最強(qiáng)，在－574～－182 bp區(qū)域存在RELMβ基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵順式調(diào)控元件，TFSEARCH和Genomatix Mat Inspector軟件分析這一區(qū)域(匹配率參數(shù)分別設(shè)為90和0.9)，發(fā)現(xiàn) SRY、Cdx2、GATA-1 和 MZF1 匹配率較高。性別決定轉(zhuǎn)錄因子(SRY)是一類含有HMG-box DNA結(jié)合區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子，在睪丸特異性表達(dá)，在腸道組織的表達(dá)還未發(fā)現(xiàn)，因此本研究得到的SRY結(jié)合位點(diǎn)可能是同樣含有HMG-box DNA結(jié)合區(qū)的類SRY基因，又稱SOX基因，Rath等研究SMP30基因(在肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá))啟動(dòng)子區(qū)活性也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象［12］。SOX基因是一類與發(fā)育相關(guān)的基因，部分SOX基因(如SOX17)可以通過(guò)Wnt信號(hào)通路抑制與結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂有關(guān)的靶基因表達(dá)［13］。尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(Cdx2)僅在成體腸道中表達(dá)，是腸特異性轉(zhuǎn)錄因子，在腸上皮發(fā)育以及腸表型分化和維持中起到重要作用［14］，研究還發(fā)現(xiàn)，Cdx2可以特異性結(jié)合于黏液蛋白因子MUC2的啟動(dòng)子，提高M(jìn)UC2的表達(dá)水平［15］。鄭麗端等在人RELMβ基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)核心調(diào)控元件Cdx2能顯著增強(qiáng)啟動(dòng)子活性［11］，進(jìn)一步證明Cdx2在調(diào)控哺乳動(dòng)物RELMβ基因啟動(dòng)子活性中起到重要作用。髓樣鋅指蛋白1(MZF-1)通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶C-alpha的轉(zhuǎn)錄活性參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡［16］，Chelbi等研究發(fā)現(xiàn)MZF-1是SERPINA3基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程不可缺少的轉(zhuǎn)錄因子，MZF-1結(jié)合在SERPINA3基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)可以激活其抗菌防御作用［17］。GATA家族是一類含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)育時(shí)期能促進(jìn)胃腸道的正常發(fā)育，并有助于在成年腸上皮細(xì)胞的不斷更新中調(diào)節(jié)組織分化，在體內(nèi)，GATA-1和c-Myb的相互作用會(huì)抑制GATA-1與DNA的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和c-Myb相互抑制各自的轉(zhuǎn)錄活性［18］，本研究中豬RELMβ基因啟動(dòng)子區(qū)包含GATA-1和c-Myb結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明GATA-1和c-Myb很有可能參與了RELMβ基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

豬和人RELMβ基因啟動(dòng)子區(qū)都存在CdxA，SRY，NFKB，NKX-2，c-Myb，GATA-1，GATA-3，C/EBP，MZF1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明抵抗素樣家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式在進(jìn)化上有保守性。下一步工作將通過(guò)定點(diǎn)突變和缺失等方法進(jìn)一步探究RELMβ基因的核心啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄活性受哪些轉(zhuǎn)錄因子影響。

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