俞正玉， 張碧成， 張 強(qiáng)， 汪 偉， 何孔旺， 倪艷秀， 溫立斌， 李 彬， 周 萍，張雪寒

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)O157∶ H7 是常見的腸道致病菌，感染該菌可引起腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡，致死率達(dá)5% ～10%［1-2］。1982 年，Riley 等報(bào)道了由EHEC O157∶ H7 引起的出血性結(jié)腸炎的暴發(fā)流行，這也是把EHEC O157∶ H7 確認(rèn)為嚴(yán)重致病菌的首次報(bào)道［3］。隨后在加拿大、日本、英國、澳大利亞等地發(fā)生了多起該菌的感染流行［4］。1999年，在中國安徽、江蘇兩省曾暴發(fā)流行EHEC O157∶ H7 感染性腹瀉，患者超過2.0 ×104人，死亡177 人，流行時(shí)間7 個(gè)月，可能是迄今為止世界上流 行 規(guī) 模 最 大 的 一 次［5］。中 國 已 將 EHEC O157∶ H7 列為21 世紀(jì)可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12 種病原微生物之一。

奶牛場是EHEC O157∶ H7主要存在場所之一，動(dòng)物排泄物極易污染鮮奶。隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，國民對鮮奶和奶制品的需求量逐年增加，加強(qiáng)對奶制品中EHEC O157∶ H7監(jiān)測勢在必行。目前檢測EHEC O157∶ H7的國標(biāo)方法仍然以常規(guī)的平板培養(yǎng)和細(xì)菌分離為主。近年來，以不同基因?yàn)闄z測靶標(biāo)的PCR、定量PCR 技術(shù)層出不窮，也不乏高通量的基因芯片技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、夾心ELISA、乳膠凝集檢測方法等，這些檢測技術(shù)各有優(yōu)勢，同時(shí)也存在種種缺陷，諸如操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、儀器要求高、靈敏度或特異性不強(qiáng)等缺點(diǎn)［6-9］。PCR 是一種既簡便又易于掌握的方法，也被廣泛應(yīng)用到EHEC O157∶ H7 的快速診斷中，但假陽性和PCR 污染等弊端仍然無法避免。而熒光定量PCR方法技術(shù)則是在普通PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入特異性引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，使用實(shí)時(shí)監(jiān)測的熒光PCR 檢測儀來檢測靶標(biāo)核苷酸。該技術(shù)除了具有普通PCR 的優(yōu)點(diǎn)外，還具有更多優(yōu)點(diǎn):特異性更高，靈敏性更高;全封閉反應(yīng)，無需PCR 產(chǎn)物的后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性;可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢;不接觸有毒試劑，操作簡單;有利于規(guī)模化、自動(dòng)化。

我們在前期研究中分析了EHEC O157∶ H7全基因組序列，發(fā)現(xiàn)Z0372 基因只存在于EHEC O157∶ H7基因組中，為標(biāo)簽性基因。因此，本研究選用EHEC O157∶ H7參考菌株EDL933、非EHEC O157 菌株和腸道菌株沙門氏菌、志賀氏菌等，建立以Z0372 基因?yàn)闄z測靶基因的定量PCR，區(qū)分檢測類似病原菌，并進(jìn)一步用于鮮奶樣品監(jiān)測，為研制新型EHEC O157∶ H7檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗(yàn)菌株有:EHEC O157∶ H7 EDL933 菌株，人源EHEC O157∶ H7菌株882364、C118、C119、C120、C121、C122、C123、C159，其他大腸桿菌O25、O26、O55、O78、O103、O111、O127、O145、O138、O139、O141、非致病性大腸桿菌K12，以及沙門氏桿菌、巴氏桿菌、糞鏈球菌、葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、乳酸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌2a、普羅威登斯菌。菌種均為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑和儀器有:2 ×Premix Ex Taq、DL-2000 DNA marker、pMD18-T 載體(TaKaRa 公司)、細(xì)菌DNA 提取試劑盒(福際生物公司)、山梨醇麥康凱(Sorbitol macconkey，SMAC)培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和新生霉素(南京助研生物公司)、anti-E.coli O157 免疫磁珠(Dynabeads 公司)、ABI 7500 定量PCR 儀。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根 據(jù) GenBank 上 發(fā) 表 的 EHEC O157∶ H7 EDL933(登錄號:AE005174)Z0372 基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，擴(kuò)增片段為119 bp。引物Z0372-F(5'-GCCAGGCAAATATGTTTGTGA-3')、Z0372-R (5'-CATTTGGCATTTGAACGATGAA-3')和Z0372-P(5'-CCTGGATACCGCTACTCAAATTCTGTCAAAAT-3')，由TaKaRa 公司合成，稀釋濃度10 pmol/μl，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR 擴(kuò)增和定量用標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用Z0372-F/R 引物對PCR 擴(kuò)增Z0372 片段，按照試劑盒說明書回收擴(kuò)增產(chǎn)物，并將PCR 產(chǎn)物克隆到pMD-19-T 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5a，酶切鑒定陽性質(zhì)粒pTZ372，作為定量標(biāo)準(zhǔn)品備用。用蛋白質(zhì)核酸定量儀測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)每個(gè)陽性質(zhì)粒大小為2 799 bp 和每個(gè)陽性質(zhì)粒質(zhì)量為1.43 ×10－18g，制備1μl 7 ×107拷貝的質(zhì)粒DNA 溶液。由于Z0372 基因在EHEC O157∶ H7基因組中是單拷貝，所以可以用質(zhì)粒pTZ372 作為標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 條件的優(yōu)化

采用Taqman 探針法，在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。以最小的Ct 值和最高的熒光值為標(biāo)準(zhǔn)，分別對退火溫度、引物和探針濃度、延伸時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 重復(fù)性、特異性和敏感性試驗(yàn)

用同處理同濃度的EHEC O157∶ H7 EDL933菌株，以 及EHEC O157∶ H7 菌 株882364、C118、C119、C120、C121、C122、C123、C159，其他大腸桿菌O25、O26、O55、O78、O103、O111、O127、O145、O138、O139、O141，非致病性大腸桿菌K12，以及沙門氏桿菌、巴氏桿菌、痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌2a 的DNA 模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增，檢驗(yàn)其穩(wěn)定性、特異性。

將方法1.4 中制備的10 倍倍比稀釋后的質(zhì)粒DNA 溶液(1 μl 7 ×106拷貝、7 ×105拷貝、7 ×104拷貝、7 ×103拷貝、7 ×102拷貝和7 ×101拷貝)，進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，以檢驗(yàn)其靈敏性。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)樣品(質(zhì)粒pTZ372)10 倍倍比稀釋成1 μl 7 ×106拷貝、7 ×105拷貝、7 ×104拷貝、7 ×103拷貝、7 ×102拷貝和7 ×101拷貝的質(zhì)粒DNA 溶液，定量PCR 擴(kuò)增后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 模擬陽性樣品的制備

用接種環(huán)蘸?。?0 ℃保存的EHEC O157∶ H7菌種，劃線接種于山梨醇麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)20 h。取單個(gè)菌落接種5 ml LB 液體培養(yǎng)基(含新生霉素50 μg/ml)，培養(yǎng)20 h。取細(xì)菌培養(yǎng)液1 ml，12 000 r/min離心5 min，沉淀用滅菌生理鹽水洗滌3 次，再用100 μl TE 緩沖液重懸。用滅菌生理鹽水將EHEC O157∶ H7培養(yǎng)物10 倍比稀釋，涂布山梨醇麥康凱瓊脂平板，菌落計(jì)數(shù)。

從奶牛場采集鮮奶，用TaqMan ? EHEC O157∶ H7檢測試劑盒(Applied System 公司)進(jìn)行檢測，選用EHEC O157∶ H7陰性鮮奶。鮮奶分裝每管20 ml，依次加入不同濃度的EHEC O157∶ H7菌液，終濃度分別為3 ×106CFU/ml、3 ×105CFU/ml、3 ×104CFU/ml、3 ×103CFU/ml、3 × 102CFU/ml、3 ×101CFU/ml、3 ×100CFU/ml，震蕩混勻后，取1 ml用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取鮮奶中細(xì)菌DNA。

1.9 鮮奶樣品的檢測

1.9.1 樣品采集 在南京市選取3 家奶牛場采集鮮奶樣品，分3 個(gè)批次采集:2014 年6 月湯山某奶牛場采集鮮奶22 份;2014 年8 月江寧某奶牛場采集鮮奶44 份;2014 年11 月浦口某奶牛場采集鮮奶24 份。

1.9.2 樣品處理 取25 ml 鮮奶加入到225 ml mEC 肉湯培養(yǎng)基(含新生霉素50 μg/ml)，42 ℃過夜培養(yǎng)(18 ～20 h)。次日，取1 ml 培養(yǎng)物500 r/min離心10 min，取上清12 000 r/min離心5 min，沉淀用100 μl TE 重懸。用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，即為待檢模板。同時(shí)吸取1ml 培養(yǎng)物，進(jìn)行免疫磁珠富集，涂布SMAC 平板，挑取在平板上圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊、直徑約1 ～2 mm 的菌落，對顏色為無色半透明的可疑大腸桿菌O157∶ H7菌落，用定量PCR 和rfbE/fliC 雙重PCR［10］再鑒定。

1.9.3 測序分析 將定量PCR 和rfbE/fliC 雙重PCR 鑒定陽性擴(kuò)增條帶送金斯瑞生物有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量PCR 擴(kuò)增最佳條件

采用探針法，在ABI 7500 定量PCR 儀上建立25.0 μl 反應(yīng)體系，以擴(kuò)增效率90% ～115%、相關(guān)系數(shù)0.990 以上、無模板對照不出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)［11］。引物與探針濃度比例為1∶ 1 和1∶ 2 的擴(kuò)增效率差異不明顯，因此確定引物探針引物比例為1∶ 1。比較3 種退火條件60 ℃30 s、62 ℃30 s 和63℃30 s，62 ℃30 s 時(shí)，無模板對照的Ct 值最大(≥35)，表明陰性對照成立，無非特異性擴(kuò)增。根據(jù)上述結(jié)果確定定量PCR 體系為:2×PCR 擴(kuò)增預(yù)混合溶液12.5 μl，引物Z0372-F、Z0372-R 和Z0372-P 各1.0 μl(10 pmol/μl)，模板DNA 1.0 μl，補(bǔ)加ddH2O 8.5 μl，總體積25.0 μl。PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃10 s，62 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。

2.2 Z0372 基因熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將10 倍倍比稀釋的陽性質(zhì)粒pTZ372 溶液進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增，以模板拷貝數(shù)(模板濃度)為x 軸，Ct 值為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y =－3.059x+38.097，相關(guān)系數(shù)0.996，標(biāo)準(zhǔn)曲線中Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 熒光定量PCR 的敏感性、特異性和重復(fù)性

檢測10 倍倍比稀釋的陽性質(zhì)粒pTZ372，1 μl 70 拷貝的質(zhì)粒DNA 溶液仍有擴(kuò)增曲線(Ct =30.1)(圖1)。檢測模擬大腸桿菌O157∶ H7陽性鮮奶樣品，300 CFU/ml時(shí)仍有擴(kuò)增曲線(Ct =33.5)，表明該定量PCR 方法敏感性較高。

圖1 Z0372 基因熒光定量PCR 的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of Z0372 gene by real-time PCR

以大腸桿菌O157∶ H7EDL933 為陽性對照，檢測本研究所選其他菌株，所有樣品在同樣條件下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示所有大腸桿菌O157∶ H7菌株均有特異性擴(kuò)增曲線，而其他大腸桿菌O25(Ct≥35.1)、O26 (Ct≥35.6)、O55 (Ct≥34.1)、O78 (Ct≥36.1)、O103 (Ct≥36.5)、O111 (Ct≥36.8)、O127 (Ct≥36.0)、O145 (Ct≥34.5)、O138(Ct≥37.1)、O139 (Ct≥37.7)、O141 (Ct≥37.2)，

非致病性大腸桿菌K12 (Ct≥38.6)，以及沙門氏桿菌(Ct≥37.5)、巴氏桿菌(Ct≥37.8)、痢疾志賀氏菌(Ct≥38.0)、福氏志賀氏菌2a(Ct≥37.3)均為陰性。說明該方法具有較好的特異性。

組內(nèi)重復(fù)測定的變異系數(shù)(RSD)為0.27% ～1.16%，組間重復(fù)測定的變異系數(shù)(RSD)為0.31% ～1.89%，均在可接受的合理范圍內(nèi)，說明本研究建立的TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的穩(wěn)定性良好。

2.4 奶牛場鮮奶樣品大腸桿菌O157∶ H7的檢測

90 份鮮奶樣品中，定量PCR 檢測陽性樣品有2個(gè)，分別為13 號(Ct 值=18.78)和79 號(Ct 值=23.98)。將陽性PCR 產(chǎn)物回收并送金斯瑞生物有限公司測序，結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物與GenBank Z0372序列同源性為100%。

按照方法1.9.2 分離鮮奶樣品中的細(xì)菌，只有79 號樣分離到大腸桿菌O157∶ H7，單菌落Z0372定量PCR 和rfbE/fliC 雙重PCR 鑒定均為陽性，擴(kuò)增條帶序列與GenBank Z0372 序列同源性為100%。

3 討論

牛、羊、豬、雞等家畜家禽感染EHEC O157∶ H7后，可引起腹瀉，并污染畜禽的肉奶蛋制品以及水源和農(nóng)作物等，給農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，對人們的健康構(gòu)成巨大威脅。EHEC O157∶ H7在反芻動(dòng)物的流行率要顯著高于其他馴養(yǎng)動(dòng)物［12］，牛已被確認(rèn)為EHEC O157∶ H7的主要宿主和傳染源頭，據(jù)報(bào)道母牛的感染率為27. 3%，夏季有時(shí)高達(dá)35%［13］。因此，隨著國民飲食結(jié)構(gòu)改變，對鮮奶和奶制品的食入量逐年增加，加強(qiáng)對奶制品中EHEC O157∶ H7監(jiān)測勢在必行。

許多檢測技術(shù)選用EHEC O157∶ H7毒力相關(guān)基因，例如志賀毒素基因(stx1 和stx2)［14-15］、緊密素基因(eae)［16］以及共同具有的表型基因uidA［17］、fimA［18］、rfbE (O 抗原)和fliC (H 抗原)［11，19］，這些基因在檢測靶標(biāo)的檢測技術(shù)中發(fā)揮著重要作用，但也具有一定的局限性。許多致病原攜帶有stx 和eae基因，以這些基因建立的檢測技術(shù)不能直接用于EHEC O157∶ H7的鑒定;另外，選用表型基因的檢測技術(shù)需要同時(shí)檢測至少2 個(gè)基因才能夠確定是否為EHEC O157∶ H7。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，篩選病原菌特有基因建立快速檢測技術(shù)有著重要的意義。Z0372 基因是我們前期通過大量的基因序列分析和比對而發(fā)現(xiàn)的，它唯一存在于 EHEC O157∶ H7基因組中，是EHEC O157∶ H7遺傳標(biāo)志性基因，建立基于該基因的檢測方法將克服已有檢測技術(shù)的局限性。

本研究建立的Z0372 定量PCR 檢測方法可特異地檢測出鮮奶中污染的EHEC O157∶ H7，敏感性高，特異性好，可以檢測到70 個(gè)拷貝的Z0372 基因片段，病原菌最低檢測濃度為300 CFU/ml。Shen等［20］建立了以免疫磁珠和標(biāo)記納米顆粒為載體的ELISA 方法，食物中病原菌的檢測敏感性介于6.8 ×102CFU/ml和6.8 ×103CFU/ml之間。Ibekwe 等［21］建立了stx1、stx1、eae 基因和16sRNA 定量PCR，環(huán)境樣品的最低檢測限為6.8 ×103CFU/ml，敏感性低，并且不能直接明確是EHEC O157∶ H7。EHEC O157∶ H7在環(huán)境和食品中含量較低，但是致病力極強(qiáng)，幾十個(gè)細(xì)菌就能夠?qū)е氯祟惏l(fā)病甚至死亡。當(dāng)前EHEC O157∶ H7檢測技術(shù)，均需增菌后再行檢測。因牛奶中蛋白質(zhì)和脂肪含量過高，為提高牛奶中病原菌的檢測率，本研究以42 ℃培養(yǎng)選擇性增菌，減少溫度敏感菌的增長;同時(shí)，選用試劑盒提取細(xì)菌DNA，以代替普通煮沸方法，避免牛奶中蛋白質(zhì)和脂肪對DNA 聚合酶的抑制。本研究中，非EHEC O157∶ H7菌株均未檢測出陽性;在90 份奶牛場鮮奶樣品中，檢測到2 個(gè)陽性樣品，其中只有1個(gè)鮮奶樣品被成功分離到EHEC O157∶ H7。Karns等用多重PCR、定量PCR 和細(xì)菌分離法同時(shí)檢測36份牛奶，定量PCR 檢出陽性5 份，多重PCR 檢出陽性2 份，而細(xì)菌分離法只檢出1 份陽性［22］。所有研究結(jié)果表明，定量PCR 較傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法的敏感性高，并且可定量檢測，對于評估攜帶病原菌樣品的風(fēng)險(xiǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

Z0372 基因是EHEC O157∶ H7的遺傳標(biāo)志性基因，是人獸共患病原菌檢測的優(yōu)選基因，建立快速、特異和高通量的檢測技術(shù)將對防控提供有力的幫助。Wu 等通過基因芯片篩選致病性大腸桿菌K-12 和大腸桿菌O157∶ H7的差異基因，以期尋找大腸桿菌O157∶ H7的獨(dú)有致病因子，但未能得到預(yù)期結(jié)果［23］。Jin 等運(yùn)用基因芯片檢測和鑒定大腸桿菌O157∶ H7和霍亂弧菌O139，stx1、stx2 和uidA 基因被確定為大腸桿菌O157∶ H7 的代表性基因［24］。Wolter 等建立流通式化學(xué)發(fā)光芯片同時(shí)檢測大腸桿菌O157∶ H7、沙門氏桿菌和嗜肺軍團(tuán)菌，檢測敏感性分別為3 ×103CFU/ml、3 ×106CFU/ml、1 ×105CFU/ml［25］。由此可見，選用病原菌獨(dú)有的遺傳標(biāo)志性基因?qū)τ谔岣邫z測的靈敏度和通量具有重要意義。Z0372 基因是EHEC O157∶ H7遺傳標(biāo)志基因，以其為靶標(biāo)的定量PCR 可以應(yīng)用于臨床樣品EHEC O157∶ H7的檢測，尤其可以作為鮮奶樣品監(jiān)測的有力工具。

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