郜青葉，王心淼，金子夜

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院眼科,呼和浩特 010010)

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·論著·

糖尿病性和老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞凋亡與Fas、Bax基因的表達(dá)

郜青葉，王心淼，金子夜

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院眼科,呼和浩特 010010)

[摘要]目的探討糖尿病性白內(nèi)障及老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)的凋亡與Fas、Bax基因的關(guān)系。方法在白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)中取糖尿病性及老年性白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜標(biāo)本45例，應(yīng)用光鏡，電鏡觀察LECs的凋亡情況，應(yīng)用RT-PCR定量檢測Fas蛋白，Bax蛋白在白內(nèi)障LECs中的表達(dá)。結(jié)果兩種白內(nèi)障患者的LECs呈透明樣變性，細(xì)胞內(nèi)有空泡(糖尿病性白內(nèi)障LECS可見增生重疊)，細(xì)胞多呈扁平狀，大小不均，核固縮，染色質(zhì)凝聚邊緣化。糖尿病性白內(nèi)障LECs除可見凋亡小體之外，上述改變較老年性白內(nèi)障更為嚴(yán)重。兩種白內(nèi)障LECs中均有Fas、Bax蛋白表達(dá)。Fas蛋白在糖尿病性白內(nèi)障LECs中的表達(dá)平均是老年性白內(nèi)障的13.34倍，Bax蛋白在糖尿病性白內(nèi)障LECs中的 表達(dá)平均是老年性白內(nèi)障的38.12倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論兩種白內(nèi)障LECs均出現(xiàn)凋亡，F(xiàn)as、Bax基因在白內(nèi)障LECS凋亡中起重要作用。

[關(guān)鍵詞]白內(nèi)障；基因表達(dá);超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)；上皮細(xì)胞

隨著全球人口老齡化，特別是糖尿病患者發(fā)病率不斷上升，白內(nèi)障的發(fā)病率也日趨增高。近年來，許多學(xué)者認(rèn)為，晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)凋亡是非先天性白內(nèi)障發(fā)病共同的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，但LECs凋亡及其凋亡相關(guān)基因在白內(nèi)障發(fā)展過程中的具體生物學(xué)機(jī)制尚不清楚[1-2]。目前認(rèn)為Fas、Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要基因。我們應(yīng)用RT-PCR定量檢測Fas、Bax在兩種不同類型的白內(nèi)障LECs中的表達(dá)，進(jìn)一步探討Fas、Bax蛋白在白內(nèi)障細(xì)胞凋亡中的作用，為今后在控制細(xì)胞凋亡水平、預(yù)防白內(nèi)障方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1對象與方法

1.1研究對象收集2012年5月至2014年5月在我院行白內(nèi)障超乳手術(shù)的白內(nèi)障患者43例(45眼)，其中糖尿病患者22例(23眼)，年齡53~85歲(平均69.98歲)，糖尿病病史5年以上(合并視網(wǎng)膜增殖性病變3例)大于白內(nèi)障病史。入院前內(nèi)科已確診為2型糖尿病，術(shù)前空腹血糖控制在8.3 mmol/L以下，尿糖轉(zhuǎn)陰。老年性白內(nèi)障21例(22眼)，年齡55~82歲(平均年齡68.5歲)，排除其他眼疾引起白內(nèi)障的因素，白內(nèi)障術(shù)前診斷標(biāo)準(zhǔn)：視力小于0.4(裸眼、矯正)，晶狀體混濁(核2~4級(jí))，在“超乳”手術(shù)中由同一位術(shù)者完成連續(xù)環(huán)形撕囊取得中央部晶狀體前囊膜標(biāo)本，直徑>5 mm。將糖尿病性和老年性白內(nèi)障患者的晶體前囊膜標(biāo)本各5例做逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)監(jiān)測，其余樣本做光鏡及電鏡檢測。

1.2方法

1.2.1光鏡標(biāo)本制作取下晶狀體前囊膜標(biāo)本，緩沖液沖洗干凈，平鋪于載玻片，濾紙吸除水分，干燥5 min，10%中性甲醛固定1 h，蘇木素伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2電鏡標(biāo)本制作快速取材切成1 mm3小塊，放入裝有3%戊二醛的小瓶內(nèi)前固定2h；然后經(jīng)PBS漂洗3次，每次15 min；經(jīng)1%四氧化鋨后固定1 h；經(jīng)PBS漂洗3次，每次15 min；經(jīng)50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%梯度脫水，各濃度脫水時(shí)間15 min；經(jīng)浸透劑浸透、包埋劑包埋、聚合、修快、超薄切片、醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙染色后上鏡觀察。

1.2.3RT-PCR定量檢測把晶狀體前囊膜標(biāo)本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本呈粉狀后加入Trizol總RNA提取試劑保存5 min加氯仿0.2 mL，用力震蕩，離心管充分混勻，室溫下放置5~10 min，用Trizol法提取總RNA，采用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，然后采用PrimlscripttmRT.reayent.Kit.withgDNA.Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，將各樣品cDNA十倍稀釋后取2 μL做模板分別用于目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)充，同時(shí)在60~95℃進(jìn)行溶解曲線分析，取5 μLRNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠自動(dòng)成像儀保存圖像并定量分析，根據(jù)Real Time PCR原始檢測結(jié)果按照2-△△ct相對定量計(jì)算公式計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果即其他各樣品相對于對照樣品的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鏡下檢查結(jié)果光鏡下觀察白內(nèi)障LECs呈透明樣變性，細(xì)胞內(nèi)可見空泡，糖尿病性白內(nèi)障LECs有增生重疊現(xiàn)象[3]。電鏡下兩種白內(nèi)障患者LECs細(xì)胞形態(tài)大小不一，以扁平狀為主，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡變性，核固縮，胞漿濃縮，核膜皺褶呈不規(guī)則形，染色質(zhì)分布不均勻，凋亡細(xì)胞與晶體囊膜結(jié)合疏松，有部分脫離。糖尿病性白內(nèi)障LECs中可見凋亡小體，白內(nèi)障LECs中未見到凋亡小體，糖尿病性LECs凋亡情況比老年性白內(nèi)障更為嚴(yán)重。

2.2各基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線選取樣本cDNA進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60~95℃進(jìn)行融解曲線分析，儀器自動(dòng)繪制出對應(yīng)的內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均達(dá)到0.99，說明線性相光度很高,且擴(kuò)增效率均在90%以上，因此可采用此種方法和上述引物進(jìn)行后續(xù)樣本的擴(kuò)增分析。

2.3目的基因相對定量結(jié)果根據(jù)RealTimePCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。

表1　各樣品的目的基因相對表達(dá)量

從表1中分析可以看出，糖尿病患者白內(nèi)障晶狀體前囊膜樣本中Fas與Bax基因的表達(dá)顯著高于老年性患者，說明糖尿病患者白內(nèi)障晶狀體前囊膜的細(xì)胞衰老程度相比老年性患者更加嚴(yán)重[4]。由于個(gè)體差異原因，在同一種疾病的患者群體里，F(xiàn)as與Bax基因分別表達(dá)的量并不一致，但從群體角度分析，糖尿病患者的表達(dá)量顯著高于老年性患者(P<0.05)。因此，我們可以得出結(jié)論，糖尿病患者的白內(nèi)障受損程度顯著高于老年性患者。

3討論

目前有許多新技術(shù)新方法從形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化，本實(shí)驗(yàn)電鏡下觀察到凋亡細(xì)胞體積縮小變形大多呈扁平狀，與晶體囊膜脫離，與周圍細(xì)胞間隙增大，線粒體腫大，細(xì)胞密度增加，核質(zhì)濃縮，染色質(zhì)分布不均，可見凋亡小體。糖尿病性白內(nèi)障LECs細(xì)胞凋亡情況比老年性更為嚴(yán)重[5]。

Fas、Bax蛋白在促進(jìn)白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞凋亡中起重要作用，目前LECs導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生已是人們關(guān)注的熱點(diǎn)，但從客觀上來說，對細(xì)胞凋亡過程中信號(hào)傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還不夠全面，比較清楚的通路有細(xì)胞凋亡的膜受體通路、細(xì)胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學(xué)通路[6]。Fas是一種跨膜蛋白[7]，與天然配對的Fasl結(jié)合，首先Fasl誘導(dǎo)受體三聚體化，然后再細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，內(nèi)含帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD，它是死亡信號(hào)轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)連接蛋白，由兩部分組成，C端(死亡結(jié)構(gòu)域即DD結(jié)構(gòu)域)和N端(DED，死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)，DD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)和Fas分子胞內(nèi)段上的DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，再以DED和Caspases8原域中的DED相互作用，聚合多個(gè)Caspases8分子，該分子隨由單鏈酶原轉(zhuǎn)化成有活性的單鏈蛋白Caspases，它作為酶原被激活后，可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。滅活或者下調(diào)與DNA修復(fù)相關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白，由于這些蛋白功能被抑制，使細(xì)胞的增值與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。Bax蛋白是BC1-2家族中參與細(xì)胞凋亡的成員，當(dāng)誘導(dǎo)凋亡時(shí)，它從胞液遷移到線粒體和核膜。在RT-PCR檢測中，糖尿病性白內(nèi)障LECs中Fas蛋白相對定量平均是老年性白內(nèi)障LECs中的13.22倍[8]，Bax蛋白在糖尿病性白內(nèi)障LECs中的相對定量平均是老年性白內(nèi)障LECs中的38.3倍[9],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Fas蛋白與Bax蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在白內(nèi)障的形成中起著重要作用，特別是合并增值性視網(wǎng)膜病變的糖尿病性白內(nèi)障中更為顯著[10]，電鏡下也證實(shí)糖尿病性白內(nèi)障的凋亡情況比老年性白內(nèi)障更為嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們糖尿病性白內(nèi)障LECs發(fā)生凋亡的過程中可能有促進(jìn)Fas、Bax蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素[11]，如果這一因素被發(fā)現(xiàn)，就可以抑制Fas、Bax蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少和預(yù)防白內(nèi)障的發(fā)生;為今后藥物治療白內(nèi)障提供一個(gè)新思路。

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Diabetic cataracts and senile cataract lens epithelial cell apoptosis and the expression of Fas,Bax gene

GaoQingye，WangXinmiao，JinZiye

(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010010，China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the relationship between lens epithelial cells (LECs) apoptosis of the diabetic cataract and senile cataract and the expression of Fas,Bax.MethodsForty-five cases were selected from diabetic and senile patients' anterior lens capsules specimens,using light and electron microscopic to observe apoptosis of LECs,and applying RT-PCR to quantitatively detect expression of Fas and Bax in cataract LECs.ResultsThe two LECs of cataract patients were hyaline degeneration.Cells had vacuoles.(The diabetes cataract LECS visible proliferation overlap).Cells were mostly flat,uneven size,nuclear pyknosis,marginalization of chromatin condensation.In LECs of diabetic cataract,these changes above of diabetic cataract even more serious than those in senile cataract.Two kinds of cataract in the LECs had both protein expression of Fas and Bax.Fas protein expression in diabetic cataract LECs was 13.34 times as high as senile cataract.Bas protein expression in diabetic cataract LECs was 38.12 times as high as senile cataract.and significant differences was found between them(P<0.05).ConclusionThe typical apoptosis was observed in two kinds of cataract LECs.Fas and Bax genes play an important role in cataract LECs apoptosis.

[Key words]Cataract；Gene expression;Phacoemulsification；Epithelial cells

(收稿日期：2015-01-22)

Corresponding author：Jin Ziye,Email:jinziye1987@126.com

中圖分類號(hào)：R776.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.006

通信作者:金子夜，醫(yī)師，Email:jinziye1987@126.com

作者簡介：郜青葉，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:13347101200@163.com

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳基金資助(20110501)