郭 菲，侯 淼

(1.陜西省商洛市第二人民醫(yī)院檢驗科 726000；2.陜西省商洛市中心醫(yī)院檢驗科 726000)

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·論 著·

藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法在陰道加德納菌鑒定中的比較

郭 菲1，侯 淼2

(1.陜西省商洛市第二人民醫(yī)院檢驗科 726000；2.陜西省商洛市中心醫(yī)院檢驗科 726000)

目的 比較藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法在陰道加德納菌鑒定中的應(yīng)用效果。方法 收集100例宮頸分泌物標(biāo)本進(jìn)行研究，分別利用藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法進(jìn)行鑒定。觀察記錄兩種方法的最終檢測結(jié)果，并進(jìn)行比較。結(jié)果 100例標(biāo)本均分別經(jīng)藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法鑒定，最后的鑒定結(jié)果顯示，藥敏紙片擴(kuò)散法一共鑒定出陰道加德納菌36例，藥敏紙片周圍均出現(xiàn)明顯的抑菌環(huán)。利用儀器法進(jìn)行鑒定，同樣鑒定出陰道加德納菌36例。對2組的陰道加德納菌鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 在對陰道加德納菌進(jìn)行鑒定，利用藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法的最終鑒定結(jié)果一致。但藥敏紙片擴(kuò)散法較之儀器法更加簡單經(jīng)濟(jì)，實用性更強(qiáng)。

加德納菌鑒定； 藥敏紙片擴(kuò)散法； 儀器法

陰道加德納菌會導(dǎo)致細(xì)菌性陰道疾病，臨床對陰道加德納菌進(jìn)行檢測的時候可以采用不同的方法，例如藥敏紙片擴(kuò)散法、免疫熒光法、細(xì)菌分離培養(yǎng)法以及儀器法等[1]。為尋找最佳的檢測方法，本研究收集100例宮頸分泌物標(biāo)本進(jìn)行研究，分別利用藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法進(jìn)行鑒定，比較兩種方法在陰道加德納菌鑒定中的應(yīng)用效果?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1～7月商洛市第二人民醫(yī)院收治的疑為陰道加德納菌引起的細(xì)菌性陰道炎患者100例，收集其宮頸分泌物標(biāo)本進(jìn)行比較。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)部門批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 藥敏紙片擴(kuò)散法 將標(biāo)本接種在血平板，并置于35 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。(1)菌液制備：挑取孵育16～24 h的血平板上數(shù)個菌落置于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)；(2)涂布接種：無菌棉拭蘸取菌液，在試管壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液，于M-H瓊脂表面進(jìn)行3次均勻的涂布接種，每次涂布接種的時候要將平板旋轉(zhuǎn)60°。涂布接種3次之后，沿平板的內(nèi)緣進(jìn)行1周涂抹；(3)貼藥敏紙片：平板在室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子將聚茴香腦磺酸鈉(SPS)藥敏紙片和萬古霉素藥敏紙片均緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距應(yīng)大于24 mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15 mm；(4)孵育：35 ℃，16～18 h，觀察抑菌圈情況。另外，培養(yǎng)基、接種細(xì)菌的菌量、抗菌藥物紙片的質(zhì)量、孵育溫度和觀察時間、操作是否規(guī)范等均能影響最終結(jié)果。為保證結(jié)果的可靠性，需采用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株同時進(jìn)行藥敏試驗作為質(zhì)量控制的方式。觀察抑菌圈情況，紙片周圍均出現(xiàn)抑菌環(huán)，則鑒定為陰道加德納菌；若紙片周圍未出現(xiàn)抑菌環(huán)，則鑒定不是陰道加德納菌。如符合條件，經(jīng)純化增菌后，挑取菌落同時手工做法國生物梅里埃公司的API strep鏈球菌鑒定條。

1.2.2 儀器法 利用全自動細(xì)菌鑒定儀對100例標(biāo)本進(jìn)行檢測，對陰道加德納菌進(jìn)行鑒定。鑒定方法為：對標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，得到細(xì)菌的純培養(yǎng)液，對菌懸液水平進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。根據(jù)陰道加德納菌對相應(yīng)的藥敏試驗卡片予以選擇，并在充液倉中對卡片進(jìn)行充液。然后將卡片置于孵育箱中進(jìn)行孵育，自動定時得到相應(yīng)的結(jié)果，并對得到的結(jié)果進(jìn)行分析判斷。

2 結(jié) 果

2.1 兩種鑒定方法結(jié)果分析 100例標(biāo)本均分別經(jīng)藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法鑒定，結(jié)果顯示，藥敏紙片擴(kuò)散法共鑒定出陰道加德納菌36例，藥敏紙片周圍均出現(xiàn)明顯的抑菌環(huán)。利用儀器法進(jìn)行鑒定，同樣鑒定出陰道加德納菌36例。兩種鑒定方法陽性完全對應(yīng)一致，對2組陰道加德納菌鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 36例陰道加德納菌API strep鑒定條生化反應(yīng)結(jié)果分析 經(jīng)API strep鑒定條鑒定，鑒定符合率均達(dá)90%以上，見表1。

表1 36例陰道加德納菌API strep鑒定條生化

3 討 論

細(xì)菌性陰道炎是一種常見的陰道疾病，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量。在細(xì)菌學(xué)上，細(xì)菌性陰道炎表現(xiàn)為陰道內(nèi)的正常菌群被一系列致病菌(如厭氧菌等)取代，陰道加德納菌是診斷加特納陰道炎的重要指標(biāo)[2]。健康婦女陰道內(nèi)也能檢出本菌，因此，一般情況下，不做陰道加德納菌分離。余竑敏等[3]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性陰道炎可增加女性患盆腔炎的風(fēng)險，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其產(chǎn)生及復(fù)發(fā)的致病因素亦十分復(fù)雜。其中，細(xì)菌生物膜，尤其陰道加德納菌生物膜在陰道上皮的黏附，不能有效地被免疫系統(tǒng)清除或完全被抗菌藥物滅活，導(dǎo)致細(xì)菌性陰道炎治療后仍有慢性、持續(xù)性感染的狀況。馮永玲等[4]也報道，加德納菌感染與細(xì)菌性陰道炎存在密切關(guān)系，臨床應(yīng)對高危感染人群加強(qiáng)防治，減少細(xì)菌性陰道炎的發(fā)生。因此，臨床十分重視對陰道加德納菌的檢測。

目前臨床對陰道加德納菌進(jìn)行檢測的方法有很多，例如藥敏紙片擴(kuò)散法、免疫熒光法、細(xì)菌分離培養(yǎng)法以及儀器法等。有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，臨床在對細(xì)菌性陰道炎進(jìn)行診斷的時候，可以通過建立檢測陰道加德納菌的實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，從而有效地檢測出陰道加德納菌基因組DNA提取效率[5]。

臨床還可以利用藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法對其進(jìn)行檢測，陰道加德納菌在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24 h，形成針尖大小、圓形、光滑、半透明、形似露滴狀的菌落，有時有狹窄的β溶血環(huán)。一般出現(xiàn)這種形態(tài)特征的菌落，很多自動化的儀器很難鑒定出來，很多醫(yī)院就將其視為污染的革蘭陽性桿菌。而利用藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行陰道加德納菌鑒定的時候，將含有一定抗菌藥物的藥敏紙片貼在已接種陰道加德納菌的瓊脂平板上，然后，紙片中的藥物在吸收水分之后，發(fā)生擴(kuò)散現(xiàn)象，便呈現(xiàn)出一定水平梯度表現(xiàn)。于是，在紙片四周的一定范圍內(nèi)，會出現(xiàn)細(xì)菌生長抑制現(xiàn)象，出現(xiàn)明顯的抑菌圈[6-7]。而且，抑菌圈的具體范圍大小還可以體現(xiàn)出不同細(xì)菌對測定藥物的敏感情況，因此，利用藥敏紙片擴(kuò)散法，不但可以進(jìn)行細(xì)菌鑒定，還可以用來進(jìn)行藥敏試驗。本研究中，用到的藥敏試紙分別為SPS藥敏紙片和萬古霉素藥敏紙片。其中，通常情況下，SPS是作為一種抗凝劑進(jìn)行使用的，可以有效抑制特定的細(xì)菌類型，例如腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及陰道加德納菌等厭氧菌和需氧細(xì)菌。而萬古霉素則具有強(qiáng)大的革蘭陽性菌抗菌活性，對革蘭陰性菌則通常是耐藥的。于是，在普通的培養(yǎng)中，厭氧菌無法生長，鑒定的時候不需要予以考慮。而SPS無法對其他細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，周圍存在抑菌環(huán)的便只可能是陰道加德納菌和淋病奈瑟菌或者腦膜炎奈瑟菌。但是，由于萬古霉素藥敏紙片的存在，在耐藥作用下，淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌在萬古霉素藥敏試紙的周圍是不存在抑菌環(huán)的。于是，經(jīng)過排除，在SPS藥敏紙片和萬古霉素藥敏紙片周圍都存在抑菌環(huán)的便只有陰道加德納菌。因此，利用這兩種藥敏紙片的特點，結(jié)合藥敏紙片擴(kuò)散法的檢驗原理，便可以較為準(zhǔn)確地鑒定出陰道加德納菌。而隨著時代的發(fā)展，細(xì)菌鑒定的技術(shù)近十幾年得到了快速發(fā)展，從人工鑒定到自動化技術(shù)。因此，除了藥敏紙片擴(kuò)散法以外，還可以利用儀器法對陰道加德納菌進(jìn)行鑒定[8]。儀器法是利用陰道加德納菌特定的生化反應(yīng)予以鑒定，本研究中，即利用全自動細(xì)菌鑒定儀對100例標(biāo)本進(jìn)行檢測，對陰道加德納菌進(jìn)行鑒定。全自動細(xì)菌鑒定儀在進(jìn)行鑒定的時候利用的是光電比色法，按照陰道加德納菌的具體理化性質(zhì)，分析微生物分解底物導(dǎo)致pH改變的顏色變化情況。經(jīng)純化增菌后做API strep鑒定條鑒定，可以保證菌種鑒定的準(zhǔn)確性。

本次研究結(jié)果顯示，100例標(biāo)本均經(jīng)兩種方法鑒定，對鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明兩種檢測方法效果相當(dāng)。但需要注意的是，在利用儀器法進(jìn)行鑒定時，如果有些細(xì)菌發(fā)生的生化反應(yīng)和陰道加德納菌發(fā)生的生化反應(yīng)十分接近，則容易出現(xiàn)混淆，導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。另外，如果在鑒定的過程中，受到其他一些外界因素的影響，陰道加德納菌所發(fā)生的生化反應(yīng)不夠明顯，則無法順利完成鑒定，要先補充手工生化反應(yīng)之后方可進(jìn)行鑒定，這樣會增加鑒定工序和步驟，費時費力，且更容易出現(xiàn)誤差。而利用藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行鑒定的過程中，操作步驟較為簡單，工序較少。而且，儀器法在檢測過程中所使用的自動化鑒定系統(tǒng)是以自身原有數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)信息和數(shù)據(jù)對不同的細(xì)菌類型進(jìn)行鑒定的。因此，一旦出現(xiàn)數(shù)據(jù)資料不完整甚至是數(shù)據(jù)信息不準(zhǔn)確等情況，則會直接導(dǎo)致最終鑒定結(jié)果的不準(zhǔn)確。但是，就目前的實際情況來看，受到諸多因素的影響，鑒定數(shù)據(jù)庫的完備性等還有待提高，鑒定系統(tǒng)并沒有包括所有的細(xì)菌鑒定相關(guān)數(shù)據(jù)和信息等，儀器鑒定法存在十分明顯的缺陷。而且，在利用儀器法進(jìn)行細(xì)菌鑒定的時候，還需要對鑒定人員予以一定的技術(shù)培訓(xùn)，以保證鑒定時的準(zhǔn)確操作[9]。因此，較之儀器法，藥敏紙片擴(kuò)散法存在明顯的應(yīng)用優(yōu)勢，實用性更強(qiáng)。而且，本研究中，在利用藥敏紙片擴(kuò)散法對陰道加德納菌進(jìn)行鑒定的時候，為了保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，還進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制?？紤]到培養(yǎng)基、接種細(xì)菌的菌量、抗菌藥物紙片的質(zhì)量、孵育溫度和觀察時間、操作是否規(guī)范等均會對最終的鑒定結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。因此，為提高鑒定結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，在進(jìn)行鑒定的同時，本研究采用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株同時進(jìn)行藥敏試驗以進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。所以，較之儀器法，藥敏紙片擴(kuò)散法不但操作簡單，而且擁有完整的質(zhì)量控制措施，鑒定結(jié)果更加可靠。在利用藥敏紙片擴(kuò)散法對陰道加德納菌進(jìn)行鑒定的時候，要注意做好質(zhì)量控制工作。首先，在涂布接種的時候，要注意均勻密涂。貼片完成之后，不能移動紙片。如果出現(xiàn)操作失誤的情況，要重新貼片。另外，貼片操作要準(zhǔn)確、迅速，整個操作要在15 min內(nèi)全部完成。本研究結(jié)果還顯示，經(jīng)API strep鑒定條鑒定，鑒定符合率均達(dá)到90%以上，并得到不同的生化反應(yīng)陽性率。因此，陰道加德納菌的分離培養(yǎng)是十分必要的。可以根據(jù)瓊脂菌落特點，經(jīng)純化增菌后做API strep鑒定條鑒定，以保證菌種鑒定的準(zhǔn)確性。另外，在并非所有的陰道加德納菌都會發(fā)現(xiàn)線索細(xì)胞，陰道加德納菌分為2個生物型，一個是黏附型，一個是分散型，如果是黏附型，則很容易見到線索細(xì)胞；如果是分散型，則見不到線索細(xì)胞，但還有菌落形態(tài)和細(xì)菌涂片革蘭染色給研究者的提示，因此并不影響臨床鑒定[10]。但是，本研究受到研究時間以及樣本容量等因素的限制，本研究還存在一些缺陷和不足，還需要在今后的研究中予以不斷完善。

綜上所述，在對陰道加德納菌進(jìn)行鑒定，利用藥敏紙片擴(kuò)散法與儀器法的最終鑒定結(jié)果一致，但藥敏紙片擴(kuò)散法較之儀器法更加簡單經(jīng)濟(jì)，實用性更強(qiáng)。

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Comparison of disk diffusion method and instrument method in identification of Gardnerella vaginalis

GUOFei1,HOUMiao2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShangluoMunicipalSecondPeople′sHospital,Shangluo,Shaanxi726000;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShangluoMunicipalCentralHospital,Shangluo,Shaanxi726000,China)

Objective To compare the application effect of disk diffusion method and the instrument method in the identification of Gardnerella vaginalis.Methods 100 samples of cervical secretion were collected and identified by the disk diffusion method and the instrument method.The final detection result of the two methods were observed and compared.Results The 100 specimens were respectively identified by the disk diffusion method and the instrument method.The final identification results showed that 36 cases of Gardnerella vaginalis were identified by the disk diffusion method and there were obvious bacteriostatic ring around the drug sensitive paper.The same 36 cases of Gardnerella vaginalis were identified by the instrument method.The identification results had no statistical difference between the two kinds of method (P>0.05).Conclusion The disk diffusion method and instrument method have the same results for identifying Gardnerella vaginalis.But the disk diffusion method is more simple,more economic and stronger in practicability than the instrument method.

Gardnerella vaginalis identification; disk diffusion method; instrument method

郭菲，女，本科，主管檢驗師，主要從事醫(yī)院常見病原菌的耐藥趨勢及院內(nèi)感染方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.047

A

1672-9455(2015)17-2600-03

2015-02-25

2015-03-20)