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        基于組培快繁技術(shù)的白及種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)觀察

        2015-03-12 12:17:41崔瑞勤陳科力徐雷
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:萌發(fā)白及觀察

        崔瑞勤 陳科力 徐雷

        摘要:為掌握白及實(shí)生苗培育過程中的生長發(fā)育特點(diǎn),采用種子組培快繁技術(shù)育苗,并對該過程進(jìn)行動態(tài)觀察。在1/2MS+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行種子萌發(fā)及叢生芽誘導(dǎo),7 d后種子膨大成為淡黃色球狀體,21 d后種子突破種皮開始萌發(fā),30 d后開始形成原球莖,40 d后原球莖進(jìn)一步膨大、顏色逐漸轉(zhuǎn)綠,部分誘導(dǎo)出愈傷組織,2個(gè)月后原球莖基部出現(xiàn)絨毛狀,愈傷組織分化大量叢生芽。叢生芽在1/2MS+1.0 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+ 1.0 mg/L GA3培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng),約40 d即可培養(yǎng)出3~5條幼根,此后白及幼苗快速生長,即可進(jìn)行煉苗移栽。

        關(guān)鍵詞:白及;種子;組培快繁技術(shù);萌發(fā);幼苗形態(tài);觀察

        中圖分類號: S567.23+9.04文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2015)02-0238-03

        收稿日期:2014-04-24

        基金項(xiàng)目:國家扶持中藥材生產(chǎn)建設(shè)項(xiàng)目。

        作者簡介:崔瑞勤(1991—),女,碩士研究生,從事中藥資源及其品質(zhì)研究。E-mail:18995629089@163.com。

        通信作者:徐雷,博士研究生,講師,從事中藥資源及其品質(zhì)研究。E-mail:wuhanxulei@163.com。白及[Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f.]為蘭科白及屬多年生草本植物,是我國的野生資源,主要分布區(qū)域北起江蘇、河南,南至臺灣,東起浙江,西至西藏東南部。貴州的東部、西部、南部,廣西的西北、西南山區(qū)是野生白及資源的集中分布地及藥材產(chǎn)出中心[1]。當(dāng)前,貴州、云南、廣西、安徽、浙江、江西、湖北、四川等地均有白及人工栽培,以貴州、安徽、廣西三地栽培量大質(zhì)優(yōu)[2]。白及干燥塊莖可供藥用,具收斂止血、消腫生肌的功效,用于咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥[3]。白及在我國具有悠久的藥用歷史,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,距今已有2 000多年歷史,是我國民間的傳統(tǒng)中藥,現(xiàn)代研究表明白及主要活性成分為聯(lián)芐類、二氫菲,并含聯(lián)菲類、其他含菲化合物以及甾類、萜類、酯類、醚類等化合物,具有止血、抗菌、抗腫瘤、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附生長以及保護(hù)黏膜等藥理作用[4-5]。

        白及不僅具有較高的藥用價(jià)值,同時(shí)還具有較強(qiáng)的觀賞性,也是我國現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原材料,由于白及應(yīng)用廣泛,近年來市場需求量不斷增大,在繁殖受限、人工栽培量不足的背景下,其野生資源遭到大量采挖,伴隨供需矛盾的不斷凸顯,白及的價(jià)格逐年攀升。目前我國白及資源十分短缺,大量地肆意采挖致使白及野生資源急劇減少,自然生境遭到嚴(yán)重破壞,由于其瀕危稀缺,被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥用植物之一。

        當(dāng)前白及大規(guī)模人工栽培顯得尤為迫切,盡管白及生長過程中能大量產(chǎn)生種子,但種子極細(xì)小、質(zhì)輕且構(gòu)造簡單無胚乳,不具備自然萌發(fā)所需的足夠養(yǎng)分,自然條件下與相適應(yīng)的真菌共生,由真菌提供其營養(yǎng)才有可能發(fā)芽且萌發(fā)率較低,所以采用種子繁殖培育實(shí)生苗進(jìn)行栽培較困難。目前,白及栽培主要采用塊莖分離繁殖的方式,大量消耗經(jīng)濟(jì)部位用于繁殖,繁殖系數(shù)低,難以適應(yīng)規(guī)?;N植的需要,不能滿足市場需求[6]。同時(shí),由于營養(yǎng)繁殖的后代源至母株的營養(yǎng)體的個(gè)體發(fā)育并非基于遺傳意義上的重新開始,而是母體生長的延續(xù),所以這種單一繁殖方式長期使用必然引起品種退化,導(dǎo)致產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、病蟲害加重、適應(yīng)性變差等諸多問題。所以,生產(chǎn)中適當(dāng)采用種子繁殖尤為必要。

        采用無菌播種方式進(jìn)行白及種子組培快繁以獲得實(shí)生苗,在培養(yǎng)基中配制白及種子萌發(fā)所需的全部養(yǎng)分,種子萌發(fā)率高,而且通常1枚白及蒴果中種子數(shù)量高達(dá)數(shù)十萬,所以繁殖系數(shù)極大,而且以種子進(jìn)行繁殖有利于引種馴化以及優(yōu)良品種選育。所以,本試驗(yàn)采用組織培養(yǎng)技術(shù)培育白及實(shí)生苗,對白及種子的萌發(fā)、叢生芽的誘導(dǎo)、生根定植、移栽等環(huán)節(jié)展開跟蹤觀察,以期為白及大規(guī)模種子組培快繁育苗積累生產(chǎn)基礎(chǔ)。

        1材料與方法

        1.1材料、儀器與試劑

        1.1.1材料白及果實(shí)采自于湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司中藥材GAP示范園,經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳科力教授鑒定為蘭科植物白及的成熟蒴果。

        1.1.2儀器HP1500GS-B智能人工氣候培養(yǎng)箱(湖北省武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司);HVE-50高壓蒸汽滅菌器(日本株式會社平山制作所);BSC1360ⅡA2生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)

        1.1.3試劑瓊脂粉(BR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);MS培養(yǎng)基(BR,美國BIOSHARP公司);NaClO溶液(AR,西隴化工股份有限公司);赤霉酸(上海滬江生化有限公司);1-萘乙酸(天津博迪化工股份有限公司);蔗糖(AR,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)。

        1.2方法

        1.2.1果實(shí)預(yù)處理將白及未開裂成熟蒴果用流水洗凈,在超凈臺上分別用75%乙醇溶液表面消毒1 min,8% NaClO溶液消毒10 min,再用無菌水反復(fù)沖洗4~6次,然后縱向剖開蒴果,用鑷子夾取蒴果外殼,將粉末狀的種子輕輕抖落到培養(yǎng)基表面[7]。

        1.2.2培養(yǎng)基制備種子萌發(fā)培養(yǎng)基:1/2 MS+1.0 mg/L NAA;生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/2 MS+1.0 mg/L NAA+2.0g/L活性炭+1.0 mg/L GA3,培養(yǎng)基配制后于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min,備用。

        1.2.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃,光照度2 000~2 500 lx,光-暗周期12 h-12 h。

        1.2.4無菌播種在無菌條件下將白及蒴果縱向剖開,用鑷子夾取蒴果外殼,將種子輕輕抖落到萌發(fā)培養(yǎng)基上,由于每枚蒴果中所含種子數(shù)量高達(dá)數(shù)十萬,因此盡量控制培養(yǎng)基表面種子密度,使其均勻散布(圖1)。endprint

        2結(jié)果與分析

        2.1叢生芽的誘導(dǎo)

        白及種子播種于培養(yǎng)基表面后開始吸水膨脹,7 d后種子明顯變大,顏色變淺,成為淡黃色的球狀體或紡錘體(圖2-a);接種21 d后種子突破種皮開始萌發(fā)(圖2-b);30 d 后開始形成淡黃色原球莖,呈球狀(圖2-c);40 d后原球莖進(jìn)一步膨大顏色逐漸轉(zhuǎn)綠,少數(shù)原球莖頂部出現(xiàn)幼葉,有的原球莖誘導(dǎo)出愈傷組織(圖2-d);2個(gè)月后原球莖基部出現(xiàn)絨毛狀,愈傷組織分化出芽(圖2-e),長出1~2 cm的綠葉,獲得大量叢生芽(圖2-f),少數(shù)形成小的幼苗。在白及種子萌發(fā)和生長過程中發(fā)現(xiàn),白及種胚通過2種方式形成幼苗,1種方式是種胚萌發(fā)后形成淡黃色的球狀體,進(jìn)一步生長轉(zhuǎn)變?yōu)橹睆綖閹缀撩状笮〉脑蚯o,原球莖分化產(chǎn)生芽,最后發(fā)育形成幼苗(圖2-g);另1種方式是淡黃色的球狀體伸長成根狀莖后發(fā)育成小苗(圖2-h)。

        2.2生根培養(yǎng)

        將長至2~3 cm的叢生芽轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,由于加入了誘導(dǎo)根分化的NAA,約40 d即可培養(yǎng)出3~5條幼根,基部都有白色細(xì)密的叢生毛出現(xiàn)(圖3)。在生根的同時(shí)幼苗快速生長,株高明顯增加,葉片增多且葉色加深,培養(yǎng)基質(zhì)被快速消耗。

        2.3組培苗的移栽

        白及苗移栽前要進(jìn)行煉苗,在光照培養(yǎng)箱中打開培養(yǎng)盒蓋,蓋上封瓶膜煉苗2 d,移至室溫下繼續(xù)煉苗5 d,取出小苗,洗凈根部培養(yǎng)基,移栽至栽培基質(zhì)中(圖4-a)。栽培基質(zhì)按m腐殖土 ∶m蛭石=1 ∶1進(jìn)行配制,使用前消毒,移栽結(jié)束后注意保水保濕。白及苗冬天地上部分枯萎,第2年春天在原球莖基礎(chǔ)上長出新芽(圖4-b)。

        3結(jié)論與討論

        利用種子組培快繁技術(shù),通過蒴果消毒、無菌播種、叢生芽誘導(dǎo)、生根誘導(dǎo)和煉苗移栽等環(huán)節(jié)在實(shí)驗(yàn)室條件下能獲得大量白及實(shí)生苗,整個(gè)過程均在各環(huán)境因子可控條件下完成,但要將組培實(shí)生苗用于大田生產(chǎn),尚須煉苗移栽培育成種苗后定植于大田,通過試驗(yàn)雖然成功獲得了白及種苗,但由于受本地氣候不適宜白及生長的限制,并沒有進(jìn)行大田栽培實(shí)踐,而且目前也很少有用白及組織培養(yǎng)技術(shù)迅速推廣應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道(僅孟彪等通過誘導(dǎo)原塊莖獲得組培苗而非實(shí)生苗進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn),結(jié)果無塊莖的白及組培苗不能成活,且組培苗質(zhì)量優(yōu)劣與其塊莖大小密切相關(guān),塊莖越大,成活率越高[8]),因此,組培實(shí)生苗的大田定植是制約其推廣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

        試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)白及種胚可通過原球莖和根莖2種途徑形成幼苗,2種幼苗在后期的生產(chǎn)性能以及塊莖品質(zhì)均有待深入研究。試驗(yàn)中從無菌播種到大量產(chǎn)生叢生芽時(shí)間較長,需近3個(gè)月時(shí)間,由于培養(yǎng)基主要提供白及種子萌發(fā)所需養(yǎng)分,不同植物激素及其濃度促進(jìn)生長發(fā)育進(jìn)程,因此培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)和激素的含量及其種類對種胚的無菌萌發(fā)和叢生芽的分化具有非常大的影響,是組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵。培養(yǎng)基物理狀態(tài)對白及生長發(fā)育也有影響,采用液體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基可以縮短萌發(fā)時(shí)間,但褐化現(xiàn)象較固體培養(yǎng)基嚴(yán)重,古碧珠等采用液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)同科的蘭花種子時(shí)也有類似現(xiàn)象[9]。盡管白及種子萌芽和生長發(fā)育是復(fù)雜的生理過程,與其遺傳特性有關(guān),但與所處營養(yǎng)條件、外源激素、生態(tài)因子等的誘導(dǎo)密切相關(guān)。筆者觀察了在一定條件下白及的生長發(fā)育過程,而關(guān)于其生長發(fā)育進(jìn)程的植物激素調(diào)控和生長條件掌控等方面仍需進(jìn)一步深入研究。

        組培實(shí)生苗技術(shù)的突破能有效解決白及的資源問題,但針對當(dāng)前白及人工栽培中存在的生產(chǎn)技術(shù)落后、管理粗放、育種滯后、種質(zhì)創(chuàng)新不足、資源破壞嚴(yán)重等問題,應(yīng)加強(qiáng)白及優(yōu)良品種選育,并系統(tǒng)開展規(guī)范化種植及野生資源撫育更新研究,從而推動其生產(chǎn)可持續(xù)健康發(fā)展,更好滿足市場需求。

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