摘要：比較研究5種中華補血草黃酮類化合物——異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素的體外抗氧化和抗腫瘤活性。運用MTT試驗，檢測5種中華補血草黃酮類化合物對HepG2和Hela腫瘤細胞體外增殖的影響；運用DPPH自由基清除試驗，檢測中華補血草黃酮的體外抗氧化活性。研究結(jié)果可知，5種中華補血草黃酮類化合物均顯示一定抗氧化和抗腫瘤活性，但其活性強弱存在差異。本試驗條件下其抗腫瘤活性由強到弱的順序為：木樨草素>槲皮素>異鼠李素、芹菜素>異槲皮苷；體外抗氧化能力由強到弱的順序為：槲皮素>木樨草素>異鼠李素>芹菜素>異槲皮苷。結(jié)果表明，中華補血草黃酮類化合物木樨草素、槲皮素、異鼠李素、芹菜素等為中華補血草抗腫瘤作用的重要活性成分，抗腫瘤作用與其抗氧化活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：中華補血草；黃酮；抗腫瘤；抗氧化

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0297-03

收稿日期：2014-10-22

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81102817）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：201210324004）；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃（編號：2012JSSPITP2373）；江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設(shè)實驗室開放項目（編號：JLCBE10006）。

作者簡介：董蒙蒙（1991—），女，江蘇連云港人，主要從事植物藥藥理藥化學(xué)習(xí)和研究。E-mail：1249050523@qq.com。

通信作者：湯新慧，博士，教授，主要從事植物藥藥理藥化研究。Tel：（0515）88233191；E-mail：xinhuitang@sina.com。白丹花科補血草屬植物中華補血草[Limonium sinense （Girard） Kuntze]，別稱匙葉草、鹽云草、海菠菜、海赤芍等，為多年生泌鹽草本植物，喜生于鹽漬化的低洼濕地上，主要分布于我國東北、華北、華東等濱海地區(qū)[1-2]。據(jù)記載，中華補血草各部位均可入藥，有清熱解毒、止血散瘀、祛風(fēng)消炎、抗癌、抗衰老的功效。民間常用其根治療肝癌，用葉治療胃潰瘍和胃癌，用花治療宮頸癌及各種出血[3-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該植物具有抗氧化、護肝、抗病毒、抑制腫瘤細胞體外增殖等多種藥理活性[5-11]。筆者研究顯示，該植物根醇提物安全低毒，能增強機體免疫力，對抗化療藥物5-Fu的免疫抑制作用，且其本身也具有顯著抗腫瘤活性[12-13]。

中華補血草化學(xué)成分十分豐富，含有鞣質(zhì)、黃酮類、生物堿、多糖、萜類、脂肪族化合物、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等[5，14-16]。特別是中華補血草總酚含量很高，占根提取物的55.55%，主要包括黃酮類、鞣質(zhì)和酚酸等，其中黃酮類含量高達24.60%[8]，目前，已在中華補血草提取物中發(fā)現(xiàn)槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素、北美圣草素、高北美圣草素、楊梅樹皮素及其苷類等20多種黃酮類化合物[15，17-18]。已有研究證實，黃酮類化合物具有廣泛的生物活性和多種藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗誘變、抑制腫瘤形成與生長等。近年來，關(guān)于黃酮類化合物在腫瘤、心腦血管疾病等方面的應(yīng)用研究已經(jīng)比較深入，加上其低毒性的特點，已成為天然藥物和功能性食品研發(fā)的熱點之一。近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中華補血草總黃酮類化合物具有顯著抑制腫瘤細胞體外增殖作用[19]，其同屬植物二色補血草中分離得到的黃酮類化合物也具有顯著抗腫瘤活性[20]，黃酮類化合物可能是該屬植物抗腫瘤作用的活性成分。

本研究采用MTT（四甲基噻唑藍）法，研究中華補血草中5種含量豐富的黃酮類化合物——異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素[15，18]對腫瘤細胞體外增殖的抑制作用，并運用自由基清除試驗比較其體外抗氧化活性，以期為中華補血草抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和該植物的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器Spectra Max190酶標儀，美國Molecular Devices公司生產(chǎn)；Thermo Form 311 型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific 公司生產(chǎn)；TS100 型倒置光學(xué)顯微鏡，日本Nikon 公司生產(chǎn)；R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；MIS-3020全自動高壓滅菌器，日本三洋電機公司生產(chǎn)。

1.1.2試劑MTT（四甲基噻唑藍），德國Sigma公司生產(chǎn)；胎牛血清、胰蛋白酶，美國Hyclone公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3細胞株人肝癌 HepG2細胞株、人宮頸癌Hela細胞株，均購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組取處于對數(shù)生長期 、狀態(tài)良好的HepG2或Hela細胞，加入適量胰蛋白酶消化液，使貼壁細胞脫落，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制細胞懸液，計數(shù)，并將細胞密度調(diào)整至4.0×104個/mL。取細胞懸液接種于96孔板，100 μL/孔，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。24 h后，將上述96孔板中的HepG2或Hela細胞分組，吸棄各孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素，20 μmol/L 5-Fu（陽性對照），每組設(shè)4個平行孔，并設(shè)陰性對照組（細胞培養(yǎng)液）、空白組（DMEM細胞懸液），給藥后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2MTT試驗按“1.2.1”節(jié)中方法在腫瘤細胞中加入5種中華補血草黃酮類化合物孵育48 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基100 μL，MTT（5.0 g/L） 20 μL/孔，37 ℃孵育4 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入MTT（1 g/L），100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO ，100 μL/孔，振蕩使藍紫色結(jié)晶物充分溶解，用空白組調(diào)零，置酶標儀570 nm波長處測定各孔吸光度（D570 nm），記錄結(jié)果并計算樣品的抑制率：抑制率=（1-D1/D0）×100%。式中：D1為供試樣品的吸光度；D0為陰性對照的吸光度。

1.2.3DPPH自由基清除試驗向96 孔板中分別加入 100 μL 含不同濃度異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素、維生素C（陽性對照）的甲醇溶液，再分別加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液，各化合物實際終濃度分別為625、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L，混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長處測定吸光度，記為Di；同時測定不加DPPH 的樣品空白吸光度（Dj） 和加DPPH 但不加樣品（以樣品溶解液替代）的吸光度（Dk）。自由基清除率計算公式如下：清除率=[1-（Di-Dj）/Dk]×100%。

1.2.4統(tǒng)計分析所有試驗均進行3 次平行試驗（n=3），使用SPSS 11. 0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗，P<0. 05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1中華補血草5種黃酮類化合物對離體培養(yǎng)的HepG2 細胞增殖的影響

中華補血草黃酮類化合物對離體培養(yǎng)的HepG2 細胞增殖的影響見圖1。5 種補血草黃酮類化合物中異鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素在6.25～100.00 μmol/L濃度范圍內(nèi)，對HepG2腫瘤細胞體外增殖均顯示不同程度的抑制活性，抑制作用隨著濃度的增高而增強，隨著濃度升高至50 μmol/L時，化合物對腫瘤細胞增殖的抑制程度趨于平緩。對HepG2腫瘤細胞抑制活性由強到弱的順序為：木樨草素>槲皮素>異鼠李素>芹菜素>異槲皮苷。其中100 μmol/L木樨草素、槲皮素、異鼠李素對HepG2細胞的增殖抑制作用與20 μmol/L 5-Fu（抑制率543%，圖中未顯示）沒有明顯差異。異槲皮苷對HepG2 細胞體外增殖的抑制作用較弱，100 μmol/L異槲皮苷的HepG2增殖抑制率僅為20.3%。

2.2中華補血草5種黃酮類化合物對離體培養(yǎng)的Hela 細胞增殖的影響

5種中華補血草黃酮類化合物作用48 h對Hela腫瘤細胞生長的抑制作用見圖2?？梢?.25～100.00 μmol/L異鼠李素、槲皮素、木樨草素、芹菜素可顯著抑制Hela腫瘤細胞體外增殖活性，抑制作用亦隨著濃度的增高而增強，100 μmol/L 4種化合物對Hela腫瘤細胞抑制活性由強到弱的順序為：樨草素>槲皮素>異鼠李素>芹菜素。木樨草素和槲皮素對HepG2細胞的增殖抑制作用與20 μmol/L 5-Fu（抑制率402%）沒有明顯差異。6.25～100.00 μmol/L異槲皮苷對Hela腫瘤細胞體外增殖無明顯影響。

2.3中華補血草5種黃酮類化合物對DPPH自由基的清除作用

5種化合物在6.25～200.00 μmol/L濃度范圍內(nèi)均具有良好的DPPH自由基清除活性，并隨濃度的增加，清除作用增強（圖3）。其中，槲皮素對DPPH自由基清除作用最強，200 μmol/L 槲皮素的DPPH自由基清除率最高，達87.3%，高于陽性對照維生素C組，5種黃酮化合物自由基清除活性強弱順序為：槲皮素>木樨草素>異鼠李素>芹菜素>異槲皮苷。

3討論與結(jié)論

黃酮類化合物，別稱生物類黃酮，是以色酮環(huán)和苯環(huán)為基本結(jié)構(gòu)的一類化合物的總稱，為植物的次級代謝產(chǎn)物，廣泛分布于自然界。目前已發(fā)現(xiàn)的黃酮類單體化合物達9 000多種，研究證明，黃酮類化合物具有多種生物活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物可通過提高抗氧化物酶的活性、清除自由基、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等多種渠道發(fā)揮抗腫瘤作用[21]，相關(guān)抗腫瘤活性引起了廣泛關(guān)注。目前已有多個黃酮類化合物作為抗腫瘤藥物進入臨床。黃酮類化合物已成為今后新藥開發(fā)研究中值得重視的資源，具有良好的開發(fā)利用前景。

中華補血草中黃酮類化合物含量豐富，已有研究顯示，補血草屬植物黃酮類化合物具有顯著抗腫瘤活性，黃酮類化合物可能是中華補血草抗腫瘤作用的有效成分。本研究比較了中華補血草5種含量豐富的黃酮化合物——異鼠李素、槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素對腫瘤細胞體外增殖的抑制作用。MTT試驗結(jié)果表明，中華補血草中5 種黃酮類化合物均具有一定的體外抗腫瘤活性，但活性強弱存在差異。木樨草素、槲皮素、異鼠李素抗腫瘤活性較強，芹菜素次之，而異槲皮苷對HepG2 細胞體外增殖顯示較弱抑制作用，對Hela腫瘤細胞體外增殖則無明顯影響。比較結(jié)構(gòu)類似的2種化合物槲皮素與異槲皮苷發(fā)現(xiàn)，二者抗腫瘤活性存在明顯差異，可能是因為分子中C3 位的羥基被糖基取代，而C2-C3 位雙鍵是黃酮化合物抗腫瘤活性的一個關(guān)鍵因素，因此異槲皮苷抗腫瘤活性顯著下降[22]。

為進一步明確中華補血草黃酮類化合物的抗腫瘤機制，本研究運用DPPH自由基清除試驗，比較5種黃酮類化合物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)5種化合物在本試驗濃度范圍內(nèi)均具有良好的DPPH自由基清除活性，并隨濃度的增加清除作用增強。其中槲皮素、木樨草素、異鼠李素抗氧化活性較強，異槲皮苷、芹菜素較弱。進一步研究發(fā)現(xiàn)，5種黃酮的抗腫瘤活性與抗氧化活性強弱比較接近，但并不完全一致，表明中華補血草黃酮類化合物抗氧化活性是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要因素，其他抗腫瘤機制還有待于進一步研究闡明。

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