王曉東，李紅濤，楊　濤，姚　旻，朱予津

300162，武警天津總隊(duì)醫(yī)院：1.藥劑科，2.內(nèi)二科

人胃癌細(xì)胞系MKN-45中二甲雙胍對順鉑的拮抗作用

王曉東1，李紅濤2，楊濤2，姚旻2，朱予津2

300162，武警天津總隊(duì)醫(yī)院：1.藥劑科，2.內(nèi)二科

【摘要】目的初步研究二甲雙胍(metformin，Met)和Met聯(lián)合順鉑(cisplatin, Cisp)對人胃癌MKN-45細(xì)胞系的抗癌作用。方法應(yīng)用不同濃度Met和Cisp單獨(dú)或聯(lián)合處理人胃癌MKN-45細(xì)胞系，MTT法分析細(xì)胞存活率，RT-PCR檢測生存素、mTOR和Akt的mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果單獨(dú)使用Met可抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡；Met聯(lián)合Cisp時(shí)，可降低Cisp的抗增殖作用，且生存素、Akt和mTOR的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)。Met對Cisp的拮抗作用可能是通過生存素、Akt和mTOR信號通路調(diào)節(jié)。結(jié)論Met能抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞系對Cisp化療的敏感性，在患有2型糖尿病的胃癌患者中，應(yīng)該慎重將Met與Cisp聯(lián)合使用。

【關(guān)鍵詞】二甲雙胍；順鉑；胃癌；生存素

【中國圖書分類號】R753.2

Preliminary study on the antagonistic effect of metformin on cisplatinin human gastric cancer MKN-45 cellline

WANG Xiaodong1, LI Hongtao2, YANG Tao2, YAO Min2, and ZHU Yujin2.1.Pharmacy Department, 2.Second Internal Medicine Department, Tianjin Municipal Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin,300162, China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of Metformin and Metformin combined with Cisplatin on human gastric MKN-45 cell line. MethodsTreated the human gastric cancer MKN-45 cell line withof the Metformin alone or Metformin combined withCisplatinby different concentrations,thenanalysed the cell survival rate by MTT,checked mRNA levels of survivin, mTOR, and Akt by real-time PCR, and assessed the Cell apoptosis by flow cytometry. ResultsMetformin alone could inhibit theproliferation and induce apoptosis, but it diminish anti-proliferative effects of theCisplatin when they were used in combination. When MKN-45 cells were treated with Metformin and Cisplatin, the expression of survivin and mTOR were increased. The antagonistic effect of the Metformin on the Cisplatinmight be through survivin, Akt and mTOR signaling pathways. ConclusionsMet can inhibit the chemotherapy sensitivity of CispinMKN-45 human gastric cancer cell line.For gastric cancer patients with Type 2 Diabeteswho treated with Cisp,Met should be carefully used.

【Key words】metformin；cisplatin；gastric cancer；survivin

二甲雙胍(metformin，Met)是常用的以改善胰島素抵抗為主的降糖藥物[1]。Met可激活胞內(nèi)AMPK，從而抑制肝臟中的糖異生，并促進(jìn)外周組織的葡萄糖攝取[2]。近年來還有研究表明，使用Met可降低糖尿病患者結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[3, 4]。Met還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在體外可抑制乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖，并可抑制體內(nèi)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[5, 6]。另外Met還能改善糖尿病乳腺癌患者對化療的反應(yīng)[7]。目前,關(guān)于Met在腫瘤細(xì)胞中的詳細(xì)作用機(jī)制還不十分明確，有研究發(fā)現(xiàn)，Met可能通過LKB1-AMPK介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8, 9]。

順鉑(cisplatin, Cisp)是腫瘤科常用的化療藥物，廣泛應(yīng)用于治療肉瘤、淋巴瘤、生殖細(xì)胞瘤，以及卵巢癌、小細(xì)胞肺癌和胃癌等。Cisp抗癌作用的主要機(jī)制是其與DNA中嘌呤堿基相互作用，形成DNA-蛋白質(zhì)，DNA-DNA鏈交聯(lián)體，從而阻斷腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。有研究發(fā)現(xiàn)Met能提高Cisp的化療效力，使其成為基于Cisp化療的候選聯(lián)合藥物[11,12]。但在一些癌細(xì)胞中研究結(jié)果并不一致，Met還可能會(huì)拮抗抑制Cisp的化療效力[13]。Met通過抑制氧化應(yīng)激和抑制胱天蛋白酶激活抑制Cisp誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可能是通過抑制生存素(Survivin)途徑來完成的，而生存素與信號通路PI3K-AKT-mTOR又密切相關(guān)[14]。胃癌是消化道常見惡性腫瘤，每年有超過80萬人死于該病[15]。Cisp作為一種胃癌化療的傳統(tǒng)藥物，目前尚無對Met與Cisp聯(lián)合應(yīng)用的效率評估，如果這兩種藥物聯(lián)用存在拮抗作用，則對應(yīng)用Met降糖的2型糖尿病合并胃癌患者使用Cisp化療造成嚴(yán)重影響。因此，研究人胃癌細(xì)胞系MKN-45中Met是否通過AKT-mTOR途徑，促進(jìn)生存素表達(dá)，對Cisp產(chǎn)生拮抗抑制作用，可為2型糖尿病患者合并胃癌的治療提供新的證據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理胃癌MKN-45細(xì)胞系來自伊朗巴斯德研究所(德黑蘭，伊朗)，在RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)中進(jìn)行培養(yǎng)，5%CO237 ℃下補(bǔ)充10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)，然后將培養(yǎng)細(xì)胞分別用5、10、20 mg/ml濃度的Met和0.1、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml濃度的Cisp(Sigma公司，美國)分別進(jìn)行處理48 h和72 h。

1.2MTT法分析細(xì)胞存活率MTT測定法來檢測單獨(dú)應(yīng)用Met和Cisp，以及Met和Cisp聯(lián)合應(yīng)用對MKN-45細(xì)胞存活率的影響作用。將種子細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞/100 μl的密度接種于含PRMI培養(yǎng)基的96孔板中，然后設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和空白對照組，實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度的Met和(或)Cisp處理48 h和72 h，對照組不給予Met和Cisp處理。實(shí)驗(yàn)組和對照組的介質(zhì)分別用MTT溶液(0.5 mg/ml)和DMSO(3 h后)替換。進(jìn)行ELISA分析，吸光度為578 nm。計(jì)算兩組的細(xì)胞存活率，了解Met和Cisp單獨(dú)或聯(lián)合使用對胃癌細(xì)胞的作用。應(yīng)用calcusin軟件計(jì)算Met和Cisp聯(lián)合使用的復(fù)合指數(shù)(CIS)。細(xì)胞存活率計(jì)算為(%)=(ODEXP/ODCON)×100，其中ODEXP和ODCON分別是實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的光密度。

1.3RT-PCR分析生存素、Akt和mTOR基因在MKN-45細(xì)胞系的表達(dá)快速純的RNA試劑盒(Takara 公司，日本)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取RNA，應(yīng)用NanoDrop ND-1000微量分光光度計(jì)(Nanodrop公司, 美國)進(jìn)行定量分析。然后取1 μgRNA反轉(zhuǎn)錄，使用RT試劑盒(Takara Bio公司，日本)。RT-PCR應(yīng)用PCR儀(Roche Diagnostic公司，德國)進(jìn)行，使用SYBR預(yù)混液Taq技術(shù)(TakaraBio公司，日本)。分別檢測生存素、Akt和mTOR基因的表達(dá)。SYBR Green主混合物(10 μl)加入2 μl cDNA樣品，0.5 μl正向和反向引物(10 pmol)水和7 μl不含核酸酶的水(Qiagen公司，德國)，以20 μl體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。熱循環(huán)條件包括在95 ℃下進(jìn)行30 s的初始活化步驟，隨后40個(gè)循環(huán)，包括在95 ℃下5 s的變性步驟，和60 ℃ 20 s的退火/延伸步驟，引物序列見表1。進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證各個(gè)引物的單一PCR產(chǎn)物。以次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(HPRT1)擴(kuò)增作為內(nèi)部控制，在Ct(2-ΔΔCT)倍數(shù)變化方法的基礎(chǔ)上，計(jì)算每個(gè)目標(biāo)mRNA的相對表達(dá)量。

表1　RT-PCR的引物核苷酸序列

1.4流式細(xì)胞儀定量分析MKN-45細(xì)胞凋亡應(yīng)用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)雙染色試劑盒(Invitrogen公司，美國)，定量分析Cisp和Met對胃癌MKN-45細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的影響。分別應(yīng)用Cisp、Met和Met/Cisp處理細(xì)胞48 h后，收獲細(xì)胞并在冷PBS中洗滌，細(xì)胞密度調(diào)整至0.5×106個(gè)細(xì)胞/mlPBS。應(yīng)用Hoechst33342和PI雙染色，取1 μl的Hoechst 33342原液(5.0mg/ml水溶液)和1 μl的PI儲(chǔ)備液(1.0mg/ml水溶液)加入到1 ml細(xì)胞懸浮液。15 min后，將染色的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀(PartecPasIII，德國)檢測，使用激發(fā)/發(fā)射波長分別為350/461 nm 和535/617 nm。

2結(jié)果

2.1Met和Cisp對MKN-45細(xì)胞存活率的抑制作用單獨(dú)應(yīng)用Met和Cisp作用于MKN-45細(xì)胞系，兩種藥物均顯示對胃癌細(xì)胞具有抑制作用，且隨著Met和Cisp濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸下降；但是Met和Cisp聯(lián)合應(yīng)用處理MKN-45細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞的存活率并未呈更明顯下降趨勢，Cisp的抑癌作用并未比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)更顯著，反而低于單獨(dú)應(yīng)用，且隨著Met濃度的增加，細(xì)胞的存活率更進(jìn)一步降低，說明Met可拮抗Cisp的抑癌作用并呈濃度依賴關(guān)系(圖1)。

圖1　評估Met，Cisp和Met/Cisp對人胃癌細(xì)胞系MKN-45的生存率(P<0.05)

2.2生存素、Akt和mTOR基因在MKN-45細(xì)胞系的表達(dá)RT-PCR結(jié)果表明，胃癌MKN-45細(xì)胞系經(jīng)Met或Cisp單獨(dú)處理48 h后生存素表達(dá)顯著降低，但在不同濃度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，與單用Met和Cisp相比，Met聯(lián)合Cisp應(yīng)用可誘導(dǎo)生存素表達(dá)量升高，且Met劑量越大時(shí)，升高更明顯(P<0.05，圖2)。進(jìn)一步檢測Akt和mTOR基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，以驗(yàn)證Met對Cisp是否存在的拮抗特性。結(jié)果表明，Met或Cisp單獨(dú)處理48 h后，與空白對照組相比，Akt基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平有輕度增高，但不同濃度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。mTOR基因經(jīng)Met處理后表達(dá)水平有輕度減低，經(jīng)Cisp處理后表達(dá)水平有輕度增高，但不同濃度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Met聯(lián)合Cisp處理時(shí)胃癌MKN-45細(xì)胞系，與Met或Cisp單獨(dú)處理相比，Akt和mTOR的表達(dá)也顯著增加，且Met劑量越大，Akt和mTOR基因表達(dá)增加越顯著(P<0.05，圖3，圖4)。

2.3Met、Cisp對MKN-45細(xì)胞凋亡影響Hoechst33342染色，凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮比正常細(xì)胞更亮，PI染色只滲透到死細(xì)胞(FL2：PI，F(xiàn)L6：Hoechst33342)。與未處理的空白對照組相比，Met，Cisp和Met聯(lián)合Cisp處理MKN-45細(xì)胞的細(xì)胞凋亡

率顯著增高(圖5)。FlowMax軟件中得到的分析數(shù)據(jù)顯示，與未處理對照組及Met處理組相比，Cisp可誘導(dǎo)更多的MKN-45細(xì)胞凋亡，且隨著濃度增高誘導(dǎo)凋亡作用更顯著。然而當(dāng)Met與Cisp聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，與Cisp單獨(dú)應(yīng)用相比，MKN-45細(xì)胞凋亡率卻降低。Met 10 mg/ml聯(lián)合Cisp 5 μM/ml比Cisp 5μM/ml單獨(dú)應(yīng)用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率更低(P<0.05)；Met 20 mg/ml聯(lián)合Cisp 10 μM/ml比Cisp10 μM/ml單獨(dú)應(yīng)用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率更低(P<0.05)，說明Met對Cisp誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有一定的拮抗作用(圖6)。

圖2　RT-PCR檢測Met、Cisp和Met/Cisp對的

圖3　RT-PCR檢測Met、Cisp和Met/Cisp

圖4　RT-PCR檢測Met、Cisp和Met/Cisp

圖5　Met，Cisp和Met聯(lián)合Cisp處理MKN-45細(xì)胞雙染色流式細(xì)胞圖

圖6　B.Met，Cisp和Met聯(lián)合Cisp處理MKN-45細(xì)胞的凋亡率

3討論

大量研究表明，Met可降低多種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，包括結(jié)腸癌、直腸癌和胰腺癌[1,16]。此外，Met在體外培養(yǎng)的乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞還具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[17]，在體內(nèi)抗腫瘤發(fā)生和抑制血管生成[18]。還有研究報(bào)道，Met可以增強(qiáng)Cisp在乳腺癌和卵巢癌中的抗癌效果[19-21]，這與先前的報(bào)告并不一致。有研究表明，在多種其他細(xì)胞系中Met可以通過抑制氧化應(yīng)激和抑制胱天蛋白酶活化抑制Cisp抗腫瘤效果[11, 22, 23]。因此，Met對Cisp的效果可能依賴于腫瘤細(xì)胞的類型。

本研究評估了單獨(dú)應(yīng)用不同濃度的Met和Cisp以及Met和Cisp聯(lián)合應(yīng)用對胃癌MKN-45細(xì)胞系的作用。MTT和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果分析表明，Met可拮抗Cisp對胃癌MKN-45細(xì)胞系凋亡的影響，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。進(jìn)一步研究表明，這種拮抗作用可能是通過上調(diào)生存素、Akt和mTOR的轉(zhuǎn)錄來完成的[24-26]。生存素是一種可特異性抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞分裂的蛋白，其編碼基因定位于人類染色體17q25上。生存素可特異性結(jié)合到終端效應(yīng)器細(xì)胞凋亡蛋白酶胱天蛋白酶，從而抑制細(xì)胞凋亡，使機(jī)體細(xì)胞在有絲分裂后期避免凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性增殖，并促進(jìn)腫瘤向周圍組織進(jìn)行侵襲性生長或者形成癌栓，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[27]。有研究還發(fā)現(xiàn)生存素過量表達(dá)抑制依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，接受化療的食管癌患者生存素mRNA表達(dá)水平比化療耐受患者水平明顯降低，揭示生存素的mRNA和蛋白表達(dá)量與惡性腫瘤預(yù)后不良密切相關(guān)[26]。因此，生存素的過表達(dá)是腫瘤細(xì)胞對于化療耐藥性是一個(gè)極為重要的指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)Met可激活A(yù)MPK，在磷酸化狀態(tài)可通過TSC1和TSC2抑制雷帕霉素靶蛋白mTOR[21]。mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，進(jìn)化十分保守，從酵母到哺乳動(dòng)物廣泛存在。mTOR蛋白屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(PIKK)蛋白家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和調(diào)控細(xì)胞周期等方面有著重要作用。mTOR的上游信號傳導(dǎo)途徑包括經(jīng)典的PI3K-Akt-mTOR信號通路和非依賴PI3K-Akt途徑。mTOR的下游信號傳導(dǎo)途徑是通過磷酸化蛋白翻譯過程中的某些因子，參與細(xì)胞的多項(xiàng)功能，其過度活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。AMPK/mTOR也可以抑制生存素，對Met誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞的凋亡起到部分抑制作用，因此是腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)[24]。Akt也稱蛋白激酶B，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡的重要的絲氨酸-蘇氨酸激酶，是經(jīng)典的信號通路PI3K-AKT-mTOR中重要的組成部分。 AKT被活化后可磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。AKT還可促進(jìn)葡萄糖的代謝和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。 AKT磷酸化TSC1/2(tuberous sclerosis complex)，可對mTOR活化，激活蛋白的翻譯，促進(jìn)細(xì)胞的生長。AKT還可對下游靶蛋白磷酸化如磷酸化Bcl-2家族成員BAD，從而產(chǎn)生抗凋亡作用。此外，AKT還可抑制caspase的活性，從而阻止激活凋亡的級聯(lián)反應(yīng)[27-29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，對胃癌MKN-45細(xì)胞系單獨(dú)應(yīng)用Met和Cisp抑制生存素的表達(dá)，在Met單獨(dú)作用下mTOR可輕度降低，Akt可輕度增高；但Cisp單獨(dú)作用下mTOR和Akt均可輕度增高。但Met和Cisp聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，mTOR和Akt均可明顯增加，導(dǎo)致生存素的表達(dá)也明顯增加，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，造成腫瘤細(xì)胞存活率增加，引起胃癌MKN-45細(xì)胞對Cisp化療的耐藥。因此，Met與Cisp聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可拮抗降低Cisp對胃癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，其機(jī)制可能是Met激活A(yù)MPK，通過PI3K-Akt-mTOR信號傳導(dǎo)通路，引起生長素的基因和蛋白水平表達(dá)增高，繼而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，抑制胃癌細(xì)胞凋亡。因此，對于胃癌同時(shí)患2型糖尿病患者，應(yīng)用Cisp進(jìn)行化療時(shí)，降糖藥物的選擇應(yīng)慎重應(yīng)用Met，因?yàn)镸et有可能拮抗降低Cisp的化療效力。鑒于本研究僅在一種胃癌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象，在其他腫瘤細(xì)胞系及人體中，是否存在Met對Cisp的拮抗抑制作用還有待進(jìn)一步深入研究。

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(2015-01-26收稿2015-05-22修回)

(責(zé)任編輯岳建華)

作者簡介：王曉東，本科學(xué)歷，副主任藥師，E-mail:18920968578@163.com通訊作者：李紅濤，E-mail：hongtlee@126.com