王曉東，李紅濤，楊　濤，姚　旻，朱予津

300162，武警天津總隊醫(yī)院：1.藥劑科，2.內二科

人胃癌細胞系MKN-45中二甲雙胍對順鉑的拮抗作用

王曉東1，李紅濤2，楊濤2，姚旻2，朱予津2

300162，武警天津總隊醫(yī)院：1.藥劑科，2.內二科

【摘要】目的初步研究二甲雙胍(metformin，Met)和Met聯(lián)合順鉑(cisplatin, Cisp)對人胃癌MKN-45細胞系的抗癌作用。方法應用不同濃度Met和Cisp單獨或聯(lián)合處理人胃癌MKN-45細胞系，MTT法分析細胞存活率，RT-PCR檢測生存素、mTOR和Akt的mRNA表達水平，流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果單獨使用Met可抑制增殖并誘導凋亡；Met聯(lián)合Cisp時，可降低Cisp的抗增殖作用，且生存素、Akt和mTOR的mRNA表達明顯增加(P<0.05)。Met對Cisp的拮抗作用可能是通過生存素、Akt和mTOR信號通路調節(jié)。結論Met能抑制人胃癌MKN-45細胞系對Cisp化療的敏感性，在患有2型糖尿病的胃癌患者中，應該慎重將Met與Cisp聯(lián)合使用。

【關鍵詞】二甲雙胍；順鉑；胃癌；生存素

【中國圖書分類號】R753.2

Preliminary study on the antagonistic effect of metformin on cisplatinin human gastric cancer MKN-45 cellline

WANG Xiaodong1, LI Hongtao2, YANG Tao2, YAO Min2, and ZHU Yujin2.1.Pharmacy Department, 2.Second Internal Medicine Department, Tianjin Municipal Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin,300162, China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of Metformin and Metformin combined with Cisplatin on human gastric MKN-45 cell line. MethodsTreated the human gastric cancer MKN-45 cell line withof the Metformin alone or Metformin combined withCisplatinby different concentrations,thenanalysed the cell survival rate by MTT,checked mRNA levels of survivin, mTOR, and Akt by real-time PCR, and assessed the Cell apoptosis by flow cytometry. ResultsMetformin alone could inhibit theproliferation and induce apoptosis, but it diminish anti-proliferative effects of theCisplatin when they were used in combination. When MKN-45 cells were treated with Metformin and Cisplatin, the expression of survivin and mTOR were increased. The antagonistic effect of the Metformin on the Cisplatinmight be through survivin, Akt and mTOR signaling pathways. ConclusionsMet can inhibit the chemotherapy sensitivity of CispinMKN-45 human gastric cancer cell line.For gastric cancer patients with Type 2 Diabeteswho treated with Cisp,Met should be carefully used.

【Key words】metformin；cisplatin；gastric cancer；survivin

二甲雙胍(metformin，Met)是常用的以改善胰島素抵抗為主的降糖藥物[1]。Met可激活胞內AMPK，從而抑制肝臟中的糖異生，并促進外周組織的葡萄糖攝取[2]。近年來還有研究表明，使用Met可降低糖尿病患者結直腸癌、肝癌、胰腺癌的風險[3, 4]。Met還可以誘導細胞凋亡，在體外可抑制乳腺癌和卵巢癌細胞的增殖，并可抑制體內腫瘤發(fā)生和進展[5, 6]。另外Met還能改善糖尿病乳腺癌患者對化療的反應[7]。目前,關于Met在腫瘤細胞中的詳細作用機制還不十分明確，有研究發(fā)現(xiàn)，Met可能通過LKB1-AMPK介導的信號轉導通路誘導細胞凋亡[8, 9]。

順鉑(cisplatin, Cisp)是腫瘤科常用的化療藥物，廣泛應用于治療肉瘤、淋巴瘤、生殖細胞瘤，以及卵巢癌、小細胞肺癌和胃癌等。Cisp抗癌作用的主要機制是其與DNA中嘌呤堿基相互作用，形成DNA-蛋白質，DNA-DNA鏈交聯(lián)體，從而阻斷腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡[10]。有研究發(fā)現(xiàn)Met能提高Cisp的化療效力，使其成為基于Cisp化療的候選聯(lián)合藥物[11,12]。但在一些癌細胞中研究結果并不一致，Met還可能會拮抗抑制Cisp的化療效力[13]。Met通過抑制氧化應激和抑制胱天蛋白酶激活抑制Cisp誘導的細胞凋亡，可能是通過抑制生存素(Survivin)途徑來完成的，而生存素與信號通路PI3K-AKT-mTOR又密切相關[14]。胃癌是消化道常見惡性腫瘤，每年有超過80萬人死于該病[15]。Cisp作為一種胃癌化療的傳統(tǒng)藥物，目前尚無對Met與Cisp聯(lián)合應用的效率評估，如果這兩種藥物聯(lián)用存在拮抗作用，則對應用Met降糖的2型糖尿病合并胃癌患者使用Cisp化療造成嚴重影響。因此，研究人胃癌細胞系MKN-45中Met是否通過AKT-mTOR途徑，促進生存素表達，對Cisp產(chǎn)生拮抗抑制作用，可為2型糖尿病患者合并胃癌的治療提供新的證據(jù)。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)和處理胃癌MKN-45細胞系來自伊朗巴斯德研究所(德黑蘭，伊朗)，在RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)中進行培養(yǎng)，5%CO237 ℃下補充10%胎牛血清(Invitrogen公司，美國)，然后將培養(yǎng)細胞分別用5、10、20 mg/ml濃度的Met和0.1、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml濃度的Cisp(Sigma公司，美國)分別進行處理48 h和72 h。

1.2MTT法分析細胞存活率MTT測定法來檢測單獨應用Met和Cisp，以及Met和Cisp聯(lián)合應用對MKN-45細胞存活率的影響作用。將種子細胞以每孔5000個細胞/100 μl的密度接種于含PRMI培養(yǎng)基的96孔板中，然后設立實驗組和空白對照組，實驗組給予不同濃度的Met和(或)Cisp處理48 h和72 h，對照組不給予Met和Cisp處理。實驗組和對照組的介質分別用MTT溶液(0.5 mg/ml)和DMSO(3 h后)替換。進行ELISA分析，吸光度為578 nm。計算兩組的細胞存活率，了解Met和Cisp單獨或聯(lián)合使用對胃癌細胞的作用。應用calcusin軟件計算Met和Cisp聯(lián)合使用的復合指數(shù)(CIS)。細胞存活率計算為(%)=(ODEXP/ODCON)×100，其中ODEXP和ODCON分別是實驗組和對照組細胞的光密度。

1.3RT-PCR分析生存素、Akt和mTOR基因在MKN-45細胞系的表達快速純的RNA試劑盒(Takara 公司，日本)從培養(yǎng)的細胞中提取RNA，應用NanoDrop ND-1000微量分光光度計(Nanodrop公司, 美國)進行定量分析。然后取1 μgRNA反轉錄，使用RT試劑盒(Takara Bio公司，日本)。RT-PCR應用PCR儀(Roche Diagnostic公司，德國)進行，使用SYBR預混液Taq技術(TakaraBio公司，日本)。分別檢測生存素、Akt和mTOR基因的表達。SYBR Green主混合物(10 μl)加入2 μl cDNA樣品，0.5 μl正向和反向引物(10 pmol)水和7 μl不含核酸酶的水(Qiagen公司，德國)，以20 μl體系進行PCR反應。熱循環(huán)條件包括在95 ℃下進行30 s的初始活化步驟，隨后40個循環(huán)，包括在95 ℃下5 s的變性步驟，和60 ℃ 20 s的退火/延伸步驟，引物序列見表1。進行熔解曲線分析，以驗證各個引物的單一PCR產(chǎn)物。以次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶1(HPRT1)擴增作為內部控制，在Ct(2-ΔΔCT)倍數(shù)變化方法的基礎上，計算每個目標mRNA的相對表達量。

表1　RT-PCR的引物核苷酸序列

1.4流式細胞儀定量分析MKN-45細胞凋亡應用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)雙染色試劑盒(Invitrogen公司，美國)，定量分析Cisp和Met對胃癌MKN-45細胞系細胞凋亡的影響。分別應用Cisp、Met和Met/Cisp處理細胞48 h后，收獲細胞并在冷PBS中洗滌，細胞密度調整至0.5×106個細胞/mlPBS。應用Hoechst33342和PI雙染色，取1 μl的Hoechst 33342原液(5.0mg/ml水溶液)和1 μl的PI儲備液(1.0mg/ml水溶液)加入到1 ml細胞懸浮液。15 min后，將染色的細胞通過流式細胞儀(PartecPasIII，德國)檢測，使用激發(fā)/發(fā)射波長分別為350/461 nm 和535/617 nm。

2結果

2.1Met和Cisp對MKN-45細胞存活率的抑制作用單獨應用Met和Cisp作用于MKN-45細胞系，兩種藥物均顯示對胃癌細胞具有抑制作用，且隨著Met和Cisp濃度的增加，細胞的存活率逐漸下降；但是Met和Cisp聯(lián)合應用處理MKN-45細胞系時，細胞的存活率并未呈更明顯下降趨勢，Cisp的抑癌作用并未比單獨應用時更顯著，反而低于單獨應用，且隨著Met濃度的增加，細胞的存活率更進一步降低，說明Met可拮抗Cisp的抑癌作用并呈濃度依賴關系(圖1)。

圖1　評估Met，Cisp和Met/Cisp對人胃癌細胞系MKN-45的生存率(P<0.05)

2.2生存素、Akt和mTOR基因在MKN-45細胞系的表達RT-PCR結果表明，胃癌MKN-45細胞系經(jīng)Met或Cisp單獨處理48 h后生存素表達顯著降低，但在不同濃度間無統(tǒng)計學差異。然而，與單用Met和Cisp相比，Met聯(lián)合Cisp應用可誘導生存素表達量升高，且Met劑量越大時，升高更明顯(P<0.05，圖2)。進一步檢測Akt和mTOR基因的轉錄表達水平，以驗證Met對Cisp是否存在的拮抗特性。結果表明，Met或Cisp單獨處理48 h后，與空白對照組相比，Akt基因的轉錄表達水平有輕度增高，但不同濃度間無統(tǒng)計學差異。mTOR基因經(jīng)Met處理后表達水平有輕度減低，經(jīng)Cisp處理后表達水平有輕度增高，但不同濃度間無統(tǒng)計學差異。Met聯(lián)合Cisp處理時胃癌MKN-45細胞系，與Met或Cisp單獨處理相比，Akt和mTOR的表達也顯著增加，且Met劑量越大，Akt和mTOR基因表達增加越顯著(P<0.05，圖3，圖4)。

2.3Met、Cisp對MKN-45細胞凋亡影響Hoechst33342染色，凋亡細胞染色質濃縮比正常細胞更亮，PI染色只滲透到死細胞(FL2：PI，F(xiàn)L6：Hoechst33342)。與未處理的空白對照組相比，Met，Cisp和Met聯(lián)合Cisp處理MKN-45細胞的細胞凋亡

率顯著增高(圖5)。FlowMax軟件中得到的分析數(shù)據(jù)顯示，與未處理對照組及Met處理組相比，Cisp可誘導更多的MKN-45細胞凋亡，且隨著濃度增高誘導凋亡作用更顯著。然而當Met與Cisp聯(lián)合應用時，與Cisp單獨應用相比，MKN-45細胞凋亡率卻降低。Met 10 mg/ml聯(lián)合Cisp 5 μM/ml比Cisp 5μM/ml單獨應用誘導的細胞凋亡率更低(P<0.05)；Met 20 mg/ml聯(lián)合Cisp 10 μM/ml比Cisp10 μM/ml單獨應用誘導的細胞凋亡率更低(P<0.05)，說明Met對Cisp誘導的細胞凋亡具有一定的拮抗作用(圖6)。

圖2　RT-PCR檢測Met、Cisp和Met/Cisp對的

圖3　RT-PCR檢測Met、Cisp和Met/Cisp

圖4　RT-PCR檢測Met、Cisp和Met/Cisp

圖5　Met，Cisp和Met聯(lián)合Cisp處理MKN-45細胞雙染色流式細胞圖

圖6　B.Met，Cisp和Met聯(lián)合Cisp處理MKN-45細胞的凋亡率

3討論

大量研究表明，Met可降低多種癌癥的風險，包括結腸癌、直腸癌和胰腺癌[1,16]。此外，Met在體外培養(yǎng)的乳腺癌和卵巢癌細胞還具有抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用[17]，在體內抗腫瘤發(fā)生和抑制血管生成[18]。還有研究報道，Met可以增強Cisp在乳腺癌和卵巢癌中的抗癌效果[19-21]，這與先前的報告并不一致。有研究表明，在多種其他細胞系中Met可以通過抑制氧化應激和抑制胱天蛋白酶活化抑制Cisp抗腫瘤效果[11, 22, 23]。因此，Met對Cisp的效果可能依賴于腫瘤細胞的類型。

本研究評估了單獨應用不同濃度的Met和Cisp以及Met和Cisp聯(lián)合應用對胃癌MKN-45細胞系的作用。MTT和流式細胞術的結果分析表明，Met可拮抗Cisp對胃癌MKN-45細胞系凋亡的影響，促進腫瘤細胞生長。進一步研究表明，這種拮抗作用可能是通過上調生存素、Akt和mTOR的轉錄來完成的[24-26]。生存素是一種可特異性抑制細胞凋亡和調控細胞分裂的蛋白，其編碼基因定位于人類染色體17q25上。生存素可特異性結合到終端效應器細胞凋亡蛋白酶胱天蛋白酶，從而抑制細胞凋亡，使機體細胞在有絲分裂后期避免凋亡，從而促進腫瘤細胞發(fā)生惡性增殖，并促進腫瘤向周圍組織進行侵襲性生長或者形成癌栓，發(fā)生遠處轉移[27]。有研究還發(fā)現(xiàn)生存素過量表達抑制依托泊苷誘導的細胞凋亡，接受化療的食管癌患者生存素mRNA表達水平比化療耐受患者水平明顯降低，揭示生存素的mRNA和蛋白表達量與惡性腫瘤預后不良密切相關[26]。因此，生存素的過表達是腫瘤細胞對于化療耐藥性是一個極為重要的指標。有研究發(fā)現(xiàn)Met可激活AMPK，在磷酸化狀態(tài)可通過TSC1和TSC2抑制雷帕霉素靶蛋白mTOR[21]。mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，進化十分保守，從酵母到哺乳動物廣泛存在。mTOR蛋白屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶(PIKK)蛋白家族，在調節(jié)細胞生長、增殖和調控細胞周期等方面有著重要作用。mTOR的上游信號傳導途徑包括經(jīng)典的PI3K-Akt-mTOR信號通路和非依賴PI3K-Akt途徑。mTOR的下游信號傳導途徑是通過磷酸化蛋白翻譯過程中的某些因子，參與細胞的多項功能，其過度活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。AMPK/mTOR也可以抑制生存素，對Met誘導的人胃癌細胞的凋亡起到部分抑制作用，因此是腫瘤治療的一個重要靶點[24]。Akt也稱蛋白激酶B，是調節(jié)細胞生長和凋亡的重要的絲氨酸-蘇氨酸激酶，是經(jīng)典的信號通路PI3K-AKT-mTOR中重要的組成部分。 AKT被活化后可磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子，對細胞的功能進行調節(jié)。AKT還可促進葡萄糖的代謝和細胞周期的調節(jié)。 AKT磷酸化TSC1/2(tuberous sclerosis complex)，可對mTOR活化，激活蛋白的翻譯，促進細胞的生長。AKT還可對下游靶蛋白磷酸化如磷酸化Bcl-2家族成員BAD，從而產(chǎn)生抗凋亡作用。此外，AKT還可抑制caspase的活性，從而阻止激活凋亡的級聯(lián)反應[27-29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，對胃癌MKN-45細胞系單獨應用Met和Cisp抑制生存素的表達，在Met單獨作用下mTOR可輕度降低，Akt可輕度增高；但Cisp單獨作用下mTOR和Akt均可輕度增高。但Met和Cisp聯(lián)合應用時，mTOR和Akt均可明顯增加，導致生存素的表達也明顯增加，進而抑制細胞凋亡，造成腫瘤細胞存活率增加，引起胃癌MKN-45細胞對Cisp化療的耐藥。因此，Met與Cisp聯(lián)合應用時，可拮抗降低Cisp對胃癌細胞的細胞毒性作用，其機制可能是Met激活AMPK，通過PI3K-Akt-mTOR信號傳導通路，引起生長素的基因和蛋白水平表達增高，繼而促進胃癌細胞的增殖，抑制胃癌細胞凋亡。因此，對于胃癌同時患2型糖尿病患者，應用Cisp進行化療時，降糖藥物的選擇應慎重應用Met，因為Met有可能拮抗降低Cisp的化療效力。鑒于本研究僅在一種胃癌細胞系發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象，在其他腫瘤細胞系及人體中，是否存在Met對Cisp的拮抗抑制作用還有待進一步深入研究。

【參考文獻】

[1]Iliana C Lega, Prakesh SShah, David Margel,etal. The effect of metformin on mortality following cancer among patients with diabetes[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2014, 23(10): 1974-1984.

[2]Cao J, Meng S, Chang E,etal. Low concentrations of metformin suppress glucose production in hepatocytes through AMP-activated protein kinase (AMPK)[J]. J Biol Chem，2014, 289(30):20435-20446.

[3]Lee M S, Hsu C C, Wahlqvist M L,etal. Type 2 diabetes increases and metformin reduces total, colorectal, liver and pancreatic cancer incidences in Taiwanese: a representative population prospective cohort study of 800,000 individuals[J].BMC Cancer, 2011, 11: 20.

[4]Zhang H, Gao C, Fang L,etal.Metformin and reduced risk of hepatocellular carcinoma in diabetic patients: a meta-analysis[J]. Scand J Gastroenterol, 2013,48(1):78-87.

[5]Vallianou N G, Evangelopoulos A, Kazazis C.Metformin and cancer[J].Rev Diabet Stud, 2013,10(4):228-235.

[6]Jiang X, Ma N, Wang D,etal.Metformin inhibits tumor growth by regulating multiple miRNAs in human cholangiocarcinoma[J].Oncotarget,2015,6(5):3178-3194.

[7]Oppong B A, Pharmer L A, Oskar S,etal.The effect of metformin on breast cancer outcomesin patients with type 2diabetes[J].Cancer Med,2014, 3(4):1025-1034.

[8]Qu C, Zhang W, Zheng G,etal. Metformin reverses multidrug resistance and epithelial-mesenchymal transition (EMT) via activating AMP-activated protein kinase (AMPK) in human breast cancer cells[J].Mol Cell Biochem, 2014, 386(1-2):63-71.

[9]Hadad S M, Hardie D G, Appleyard V,etal.Effects of metformin on breast cancer cell proliferation, the AMPK pathway and the cell cycle[J].Clin Transl Oncol, 2014, 16(8):746-752.

[10]Andreas R de Biasi, Jonathan Villena-Vargas, Prasad S. Adusumilli. Cisplatin-Induced antitumor immunomodulation: A review of preclinical and clinical evidence[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(11): 5384-5391.

[11]Chan J,Jung H H,Yang J Y,etal.Protectiveeffect of metformin against cisplatin- induced ototoxicity in an auditory cell line[J].J Assoc Res Otolaryngol, 2014, 15(2):149-158.

[12]Quattrini I, Conti A, Pazzaglia L,etal. Metformin inhibits growth and sensitizes osteosarcoma cell lines to cisplatin through cell cycle modulation[J].Oncol Rep, 2014, 31(1):370-375.

[13]Uehara T, Mitsuhashi A, Tsuruoka N,etal.Metformin potentiates the anticancer effects of cisplatin under normoxic conditions in vitro[J].Oncol Rep, 2015, 33(2):744-750.

[14]Huang J, Lyu H, Wang J,etal. MicroRNA regulation and therapeutic targeting of survivin in cancer[J].Am J Cancer Res, 2014, 5(1):20-31.

[15]Fock K M.Review article: the epidemiology and prevention of gastric cancer[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2014, 40(3):250-260.

[16]Ryan J O, SarojNiraula, VukStambolic,etal. Metformin in cancer: translational challenges[J]. J Mol Endocrinol, 2012, 48(3): 31-43.

[17]Zhuang Y, Chan D K, Haugrud A B,etal. Mechanisms by which low glucose enhances the cytotoxicity of metformin to cancer cells both in vitro and in vivo[J]. PLoS One, 2014, 9(9):e108444.

[18]Dallaglio K, Bruno A, Cantelmo A R,etal.Paradoxic effects of metformin on endothelial cells and angiogenesis[J].Carcinogenesis, 2014,35(5):1055-1066.

[19]Rattan R, Graham R P, Maguire J L,etal.Metformin suppresses ovarian cancer growth and metastasis with enhancement of cisplatincytotoxicity in vivo[J].Neoplasia, 2011, 13(5):483-491.

[20]Xie Y, Peng Z, Shi M,etal.Metformin combined with p38 MAPK inhibitor improves cisplatin sensitivity in cisplatinresistantovarian cancer[J].Mol Med Rep, 2014, 10(5):2346-2350.

[21]Hongyu LIU, Christian Scholz, Chuanbing ZANG,etal. Metformin and the mTOR inhibitor everolimus (RAD001) sensitize breast cancer cells to the cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs in vitro[J]. Anticancer Res, 2012, 32(5): 1627-1637.

[22]Zi F M, He J S, Li Y,etal.Metformin displays anti-myeloma activity and synergistic effect with dexamethasone in in vitro and in vivo xenograftmodels[J].Cancer Lett, 2015, 356(2):443-453.

[23]Janjetovic K, Harhaji-Trajkovic L, Misirkic-Marjanovic M,etal.In vitro and in vivo anti-melanoma action of metformin[J].Eur J Pharmacol, 2011, 668(3):373-382.

[24]Han G, Gong H, Wang Y,etal.AMPK/mTOR-mediated inhibition of survivin partly contributes to metformin-induced apoptosis in human gastric cancer cell[J].Cancer Biol Ther, 2015,16(1):77-87.

[25]Lesan V, Ghaffari S H, Salaramoli J,etal.Evaluation of antagonistic effects of metformin with Cisplatin in gastric cancer cells[J].Int J HematolOncol Stem Cell Res, 2014, 8(3):12-19.

[26]Cao W, Yang W, Fan R,etal.miR-34a regulates cisplatin-induce gastric cancer cell death by modulating PI3K/AKT/survivinpathway[J].Tumour Biol, 2014 ,35(2):1287-1295.

[27]Ettl T, Viale-Bouroncle S, Hautmann M G,etal.AKT and MET signalling mediates antiapoptoticradioresistance in head neck cancer cell lines[J].Oral Oncol,2015,51(2):158-63.

[28]Tsubaki M, Takeda T, Ogawa N,etal.Overexpression of survivin via activation of ERK1/2, Akt, and NF-κB plays a central role in vincristine resistance in multiple myeloma cells[J].Leuk Res, 2015, 39(4):445-452.

[29]Hsin I L, Ou C C, Wu M F,etal.GMI, an Immunomodulatory Protein from Ganodermamicrosporum, Potentiates Cisplatin-Induced Apoptosis via Autophagy in Lung Cancer Cells[J].Mol Pharm, 2015, 12(5):1534-1543.

(2015-01-26收稿2015-05-22修回)

(責任編輯岳建華)

作者簡介：王曉東，本科學歷，副主任藥師，E-mail:18920968578@163.com通訊作者：李紅濤，E-mail：hongtlee@126.com