孔德平，陳 凱

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院藥劑科 402160）

增生性瘢痕是各種燒、創(chuàng)傷后最常見的并發(fā)癥，易導(dǎo)致患者傷處外觀畸形及功能障礙。其形成是由于皮膚創(chuàng)傷后的愈合過程中，成纖維細(xì)胞過量增殖和膠原纖維過度增生的結(jié)果。通過傳統(tǒng)壓力治療、硅酮凝膠外用、曲安奈德局部注射治療均療效不確切，并可能因治療導(dǎo)致一系列并發(fā)癥[1]。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一類廣譜的氟化嘧啶類抗腫瘤藥物，可以通過細(xì)胞內(nèi)抑制DNA的合成，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。近年來發(fā)現(xiàn)該藥在瘢痕治療方面具有一定作用[2-3]，但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立兔耳增生性瘢痕模型，探討5-FU對(duì)兔耳創(chuàng)面瘢痕形成的影響及其作用機(jī)制，為瘢痕防治及藥物臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 兔耳增生性瘢痕模型的建立

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇12只健康新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體質(zhì)量1.5～2.5kg，月齡8～10個(gè)月。隨機(jī)分為3組，生理鹽水注射對(duì)照組（A組），5-FU 1.0mL＋生理鹽水4.0 mL，5-FU濃度5.0mg／mL局部注射組（B組），5-FU軟膏局部外用組（C組），使用2.5%5-FU軟膏，廣州白云山何濟(jì)公制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H44023085。

1.1.2 兔耳增生性瘢痕模型的制作 瘢痕模型的制作參照馮登超[4]方法建立兔耳增生性瘢痕模型。于術(shù)后60d空氣栓塞法隨機(jī)處死兔子，分別沿創(chuàng)面邊緣0.5cm處環(huán)形切開，切取含創(chuàng)面的兔耳組織，取材后的兔子即退出實(shí)驗(yàn)。所取組織均勻4等分。

1.2 蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson三色染色 10%的中性甲醛固定、脫水、包埋、切片、HE染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察，檢測(cè)組織中細(xì)胞及膠原等的改變。Masson三色染色法參照參考文獻(xiàn)[5]。

1.3 ELISA定量檢測(cè) 術(shù)后60d抽取靜脈血，按轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）、INF-γ和的ELISA試劑盒說明書分別操作，每例樣本組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。根據(jù)檢測(cè)吸光度值用Curve Expert軟件分析并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出不同條件培養(yǎng)基中各因子的濃度。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR） 按Trizol操作說明書提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA，使用反應(yīng)Real time PCR儀檢測(cè)TGF-β、PDGF、bFGF和INF-γ。檢測(cè)條件：預(yù)變性95℃，15min；變性95℃，10s，退火／延伸60℃，30s，40個(gè)循環(huán)。采用Real-time PCR儀自帶分析軟件分析各樣品各基因表達(dá)情況。相對(duì)定量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕形成情況 通過肉眼觀察，A組表現(xiàn)為斑塊質(zhì)硬，色紅。B、C組瘢痕質(zhì)地柔軟平整；且B組比C組瘢痕明顯軟化、變平。

2.2 組織切片觀察 HE染色切片結(jié)果表明，A組（圖1A）其瘢痕厚，膠原纖維多而致密粗大，排列紊亂，可見漩渦狀結(jié)構(gòu)和膠原結(jié)節(jié)，其間有少量炎性細(xì)胞，結(jié)構(gòu)近似人的增生性瘢痕組織。B組（圖1B）瘢痕厚度顯著降低，核較小，膠原纖維束間有較大的空隙，排列比較規(guī)則，呈水平方向。C組（圖1C）瘢痕厚度較薄，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，膠原纖維致密下降，表層排列規(guī)則，內(nèi)層排列方向似漩渦狀。Masson染色切片結(jié)果表明：膠原纖維呈藍(lán)色，于細(xì)胞間散在分布。與A組（圖1D）相比，B組（圖1E）及C組（圖1F）膠原纖維染色較淡，較為疏松，且二者間有明顯區(qū)別。

圖1 3組染色組織切片影像學(xué)表現(xiàn)

圖2 Real-time PCR和ELISA檢測(cè)TGF-β、PDGF、INF-γ、bFGF的表達(dá)水平

2.3 INF-γ、PDGF、bFGF和TGF-β的表達(dá)水平 通過Real-time PCR檢測(cè)，A組、B組與C組中，TGF-β、PDGF、bFGF、INF-γ的mRNA表達(dá)均有明顯下降；且B組mRNA下降幅度更大。接著采用ELISA方法對(duì)4種細(xì)胞因子的蛋白做了進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果與Real-time PCR檢測(cè)一致（圖2）。

表1 Real-time PCR引物序列

3 討論

增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)面愈合后瘢痕持續(xù)增生的一種病理現(xiàn)象，其本質(zhì)是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分過度增殖，合成并分泌膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)。瘢痕組織中膠原纖維大量沉積，排列紊亂，主要以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主。膠原的過度分泌和降解減少是膠原沉積的主要原因[6]。由于增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制目前仍未闡明，至今還缺乏具有臨床指導(dǎo)意義的防治方法。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)5-FU除了具有抗腫瘤作用，國(guó)內(nèi)外均有5-FU應(yīng)用于抗瘢痕的報(bào)道。瘢痕疙瘩切除后局部單純應(yīng)用5-FU能夠改變瘢痕疙瘩創(chuàng)面的愈合特征，合理的用藥劑量及時(shí)間尚需進(jìn)一步研究[7]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)5-FU在體外能明顯抑制人增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增殖及cyclinD1、cdk4的mRNA表達(dá)[8]。研究者采用低濃度去炎松-A（5～10 mg／mL）和5-FU（6.25mg／mL）混合液治療病理性瘢痕，也獲得了滿意的療效[9]。本研究中，通過HE及Masson實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與A組和C組比較，B組顯著改善了瘢痕組織的病理狀況。

TGF-β是促進(jìn)瘢痕增生的主要刺激因子[10]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可刺激成纖維細(xì)胞分泌纖維連接蛋白，Ⅰ、Ⅲ型膠原和前膠原。還可減少膠原酶降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，并間接地通過PDGF刺激細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，促進(jìn)瘢痕增生。其他如PDGF、bFGF等均在增生性瘢痕組織中表達(dá)增高[11-13]。他們可通過各種途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維分泌[14]?；谝陨蠙C(jī)理，為了研究5-FU抑制增生性瘢痕作用機(jī)制，作者通過Real-time PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B、C組明顯的抑制INF-γ、PDGF、bFGF、TGF-β的mRNA及蛋白的表達(dá)，且B組效果優(yōu)于C組。

本研究利用外傷性兔耳早期瘢痕增生模型，證實(shí)了5-FU通過抑制INF-γ、PDGF、bFGF、TGF-β的表達(dá)抑制兔皮膚增殖性瘢痕，且局部注射比軟膏外用抑制瘢痕增生效果更顯著。進(jìn)一步研究其作用機(jī)制、給藥方式，以及對(duì)5-FU進(jìn)行化學(xué)修飾合成，降低其不良反應(yīng)，有望開發(fā)出預(yù)防和治療人皮膚增生性瘢痕的有效藥物。

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