丁振斌　史穎弘　彭遠(yuǎn)飛　宋康　周儉　樊嘉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上?！?00032)

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氯喹在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡中的作用機(jī)制研究

丁振斌史穎弘彭遠(yuǎn)飛宋康周儉樊嘉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上海200032)

摘要目的：研究自噬抑制藥物氯喹(chloroquine，CQ)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的作用機(jī)制，探索自噬相關(guān)藥物可能的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：選取3種肝癌細(xì)胞系，給予不同濃度CQ干預(yù)24 h，采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況，采用碘化丙啶(PI)染色法檢測細(xì)胞死亡，采用Hochest33342染色、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色、Western blotting (caspase-9)法檢測凋亡。采用GFP-LC3轉(zhuǎn)染、Western blotting (LC3)及細(xì)胞電鏡技術(shù)檢測細(xì)胞自噬功能。結(jié)果：MTT檢測顯示，CQ作用24 h能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖。CQ(≥20 μmol/L)干預(yù)后，PI染色陽性細(xì)胞明顯增多，Hochest33342核染色顯示核濃聚、核碎裂，TUNEL 染色陽性細(xì)胞明顯增多，caspase-9活化；而CQ(5、10 μmol/L)干預(yù)后PI染色陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯變化。CQ處理細(xì)胞后，GFP-LC3陽性細(xì)胞明顯增多，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增高。同時(shí)用caspase抑制劑Z-VAD-FMK和3-MA或沉默Atg5的表達(dá)預(yù)處理，可顯著抑制40 μmol/L CQ誘導(dǎo)的MHCC97-L細(xì)胞的死亡。結(jié)論：CQ可以抑制肝癌細(xì)胞自噬降解，導(dǎo)致自噬小泡及自噬標(biāo)志性蛋白積聚。大劑量CQ直接誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡，其死亡形式既具有凋亡的特征又具有自噬樣死亡的特征。

關(guān)鍵詞自噬；肝細(xì)胞肝癌；凋亡；氯喹

自噬作用是細(xì)胞在饑餓、能量缺乏等代謝壓力下的一種生理過程。細(xì)胞內(nèi)的蛋白、細(xì)胞器和胞質(zhì)通過自噬作用被包裹、消化，降解成核苷、氨基酸和脂肪酸，循環(huán)利用，合成新的大分子和ATP，以維持細(xì)胞的正常代謝和生存[1]。同時(shí)，自噬作用在某些情況下可以選擇性地清除某些細(xì)胞成分，如清除受損或多余的過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、DNA，以此減少異常蛋白、細(xì)胞器的堆積，維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)[2]。自噬作用雖具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，但如過度，自噬作用也可以引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，也稱為Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡[3]。自噬作用在機(jī)體的生理和病理過程中都有其蹤跡，與人類的多種疾病，尤其是惡性腫瘤存在密切關(guān)系。

近年來研究[4]發(fā)現(xiàn)，氯喹(chloroquine，CQ)可以有效地抑制自噬降解作用，增強(qiáng)p53誘導(dǎo)凋亡的效果。而另一項(xiàng)研究[5]則發(fā)現(xiàn)，CQ小劑量時(shí)通過抑制自噬降解作用直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而大劑量時(shí)促使自噬樣死亡。因此，我們推測腫瘤自噬降解是一把雙刃劍。為了驗(yàn)證我們提出的假設(shè)，探索自噬相關(guān)藥物CQ在肝癌治療中的應(yīng)用價(jià)值，我們對不同的肝癌細(xì)胞系進(jìn)行了體外的CQ干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1資料與方法

1.1一般資料人肝癌細(xì)胞系MHCC97-L為復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立，人肝癌細(xì)胞系Hep3B、HepG2由美國康奈爾大學(xué)惠贈(zèng)。兔抗人LC3抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。小鼠抗人GAPDH抗體為上海康成生物工程有限公司產(chǎn)品。HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔IgG 抗體購自河南華美生物工程公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 及Opti-MEM為Invitrogen公司產(chǎn)品。CQ、3-MA、凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素和廣譜的凋亡抑制劑Z-VAD-FMK購自美國sigma公司。siRNA由上海吉瑪技術(shù)公司設(shè)計(jì)合成。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購自上海碧云天技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1四甲基偶氮唑鹽法(MTT)以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)(100 μL/孔)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。進(jìn)行CQ干預(yù)后棄去原培養(yǎng)液，每孔細(xì)胞加入新鮮培養(yǎng)基200 μL及MTT 液10 μL，溫育4 h后吸去培養(yǎng)液，加入DMSO 100 μL，避光搖晃15 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測量。同時(shí)設(shè)置空白孔、對照孔。每組設(shè)定6復(fù)孔。

1.2.2PI染色法檢測細(xì)胞死亡加入適當(dāng)量PI染色液，須充分覆蓋待染色的細(xì)胞，輕輕混勻，冰浴避光放置后直接在熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生死亡時(shí)，PI能穿透細(xì)胞膜，發(fā)出紅色熒光。每個(gè)孔計(jì)算10個(gè)高倍視野(×200)，每組設(shè)6復(fù)孔。

1.2.3TUNEL染色檢測凋亡用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次。在樣品中加50 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次后用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4Hoechst 33342染色檢測凋亡加入適量Hoechst 33342染色液，須充分覆蓋待染色的細(xì)胞，37℃培養(yǎng)20 min。棄染色液，用PBS洗滌1次后直接在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對各組數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，兩組計(jì)量資料間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用χ2分析。P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同濃度CQ對肝癌細(xì)胞的抑制作用MTT檢測顯示，用CQ處理24 h能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞(MHCC97-L、HepG2、Hep3B)的增殖，而且具有濃度依賴性(圖1)。PI染色結(jié)果顯示，大劑量CQ(≥20 μmol/L)干預(yù)細(xì)胞24 h后，能顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡，PI染色陽性細(xì)胞明顯增多并隨濃度增加而增多(P<0.05)，見圖2；而小劑量CQ(5、10 μmol/L)干預(yù)24 h無法誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡(P>0.05)，見圖2。

*P<0.05,**P<0.001)

圖1MTT法檢測CQ作用24 h后MHCC97-L、Hep3B及HepG2的增殖情況

2.2大劑量CQ誘導(dǎo)的肝癌MHCC97-L細(xì)胞死亡既具有凋亡的特征又具有自噬樣死亡的特征40、80 μmol/L CQ作用MHCC97-L細(xì)胞24 h后，Hochest33342核染色顯示有核濃聚、核碎裂；TUNEL染色陽性細(xì)胞明顯增多(圖3)；caspase-9的Western blotting顯示35、37 kD處可見到分裂體，提示caspase-9活化、細(xì)胞凋亡明顯，見圖3。應(yīng)用廣譜的凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(50 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞可以顯著抑制星形孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但無法抑制40 μmol/L CQ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖4)；這提示，大劑量CQ除了誘導(dǎo)凋亡以外可能促進(jìn)其他形式的細(xì)胞死亡。

*P<0.05,**P<0.001

圖2PI染色檢測CQ作用24 h后MHCC97-L、Hep3B

及HepG2細(xì)胞的死亡情況

因此，我們用電鏡對大劑量CQ(40 μmol/L)處理后的MHCC97-L細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)不僅有大量凋亡小體，而且細(xì)胞內(nèi)聚集大量含有待降解產(chǎn)物的自噬泡(圖5)。LC3的Western blotting也提示，CQ(10、40 μmol/L)可以導(dǎo)致細(xì)胞LC3蛋白特別是Ⅱ型蛋白表達(dá)顯著升高(圖6)。我們用不同劑量的CQ(10、40 μmol/L)干預(yù)GFP-LC3轉(zhuǎn)染后的MHCC97-L細(xì)胞，6 h后細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)大量的點(diǎn)狀熒光聚集，GFP-LC3陽性細(xì)胞顯著增多(圖7)。因此我們認(rèn)為不同濃度的CQ均能導(dǎo)致肝癌細(xì)胞內(nèi)自噬小泡及自噬蛋白聚積。圖6~7可見，40 μmol/L CQ較10 μmol/L CQ在短時(shí)間內(nèi)可導(dǎo)致更多的LC3-Ⅱ表達(dá)及GFP-LC3的聚集，因此大劑量CQ可能過度抑制自噬溶酶體內(nèi)的蛋白降解，自噬泡不斷增多卻無法再生細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，從而細(xì)胞發(fā)生自噬樣死亡(即Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡)。

圖3　大劑量CQ作用24 h后誘導(dǎo)MHCC97-L細(xì)胞凋亡

圖4　凋亡抑制劑Z-VAD-FMK無法抑制CQ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

然而，通過RNAi干擾自噬關(guān)鍵蛋白Atg5的表達(dá)以及用自噬抑制劑3-MA(10 mM)預(yù)處理盡管抑制了自噬小泡的形成，但不能顯著抑制 40 μmol/L CQ誘導(dǎo)的MHCC97-L細(xì)胞的死亡(圖8)，這提示單獨(dú)拮抗自噬同樣不能抑制細(xì)胞死亡。

由此我們推測，CQ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可能具有雙重的特征。我們用caspase抑制劑Z-VAD-FMK的同時(shí)應(yīng)用自噬抑制劑3-MA或用RNAi沉默Atg5的表達(dá)，PI染色后發(fā)現(xiàn)CQ誘導(dǎo)后的PI陽性MHCC97-L細(xì)胞顯著減少(圖9)。這提示，同時(shí)拮抗凋亡及自噬小泡形成，能夠抑制CQ誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，CQ誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡既具有凋亡的特征又具有自噬樣死亡的特征。

圖5　CQ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞MHCC97-L內(nèi)出現(xiàn)大量自噬泡

圖6　Western blotting分析不同劑量的CQ

圖7　GFP-LC3轉(zhuǎn)染后的MHCC97-L細(xì)胞在經(jīng)大

圖8　siRNA沉默自噬關(guān)鍵蛋白Atg5或用自噬抑制劑3-MA

*P<0.05,**P<0.001)

圖9同時(shí)用caspase抑制劑Z-VAD-FMK和自噬抑制劑

3-MA或RNAi沉默Atg5的表達(dá)后，PI染色分析

40 μmol/L CQ誘導(dǎo)的MHCC97-L細(xì)胞24 h的死亡情況

3討論

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種進(jìn)化保守的過程，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器的降解。自噬能夠減少異常蛋白、陳舊細(xì)胞器的堆積，借此維持代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，過度刺激后，持續(xù)自噬將使細(xì)胞無法重新利用代謝產(chǎn)物來合成新的營養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡(即Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡)。

CQ是一種廣泛應(yīng)用的抗瘧疾藥物。研究[6-7]表明，CQ通過提高溶酶體PH值而抑制自噬體與溶酶體的融合以及自噬溶酶體內(nèi)蛋白的降解。Amaravadi等[4]研究發(fā)現(xiàn)，CQ(5 μmol/L)可以抑制自噬降解機(jī)制，促進(jìn)p53介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。而Maclean 等[5]則認(rèn)為，CQ(50 μmol/L)可以直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，且既有凋亡的特征又有自噬性死亡的特征。因此，我們推測不同濃度的CQ對腫瘤細(xì)胞起著不同的自噬作用，從而造成了不同的結(jié)果。

我們應(yīng)用不同濃度的CQ干預(yù)3種肝癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有CQ濃度大于20 μmol/L時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞死亡，而小劑量CQ僅僅對細(xì)胞的增殖有輕微的抑制作用。自噬活性檢測發(fā)現(xiàn)，不同劑量CQ均可以抑制自噬泡的降解，導(dǎo)致自噬小泡及自噬標(biāo)志性蛋白在腫瘤細(xì)胞內(nèi)積聚。大劑量CQ可能因過度抑制自噬溶酶體內(nèi)的蛋白降解而導(dǎo)致細(xì)胞自噬樣死亡和凋亡。

此外，有研究[5]表明，CQ誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡依賴于p53。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，大劑量CQ也能夠誘導(dǎo)p53表達(dá)缺失的Hep3B細(xì)胞的凋亡及自噬樣死亡，初步提示CQ誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡可能與p53的作用無關(guān)，但仍需進(jìn)一步證明。

盡管大劑量CQ能直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，然而大劑量應(yīng)用CQ可能造成肝功能的損害。肝癌患者通常伴有肝硬化，肝功能常處于正常臨界狀態(tài)。因此，雖然大劑量CQ能抑制自噬、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞直接死亡，但可能很難應(yīng)用于肝癌的臨床治療。

綜上所述，CQ可以抑制自噬降解，消除腫瘤細(xì)胞的自噬性保護(hù)；而過度抑制自噬性降解也會(huì)直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，這種死亡形式既具有凋亡的特征又具有自噬樣死亡的特征。

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Mechanism Research on Death of Hepatic Carcinoma Cells Induced by Chloroquine

DINGZhenbinSHIYinghongPENGYuanfeiSONGKangZHOUJianFANJia

DepartmentofLiversurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To investigate the role of chloroquine (CQ) during inducing the death of hepatic carcinoma cells and to explore the clinical application of autophagy-related agents.Methods： Three kinds of hepatic carcinoma cell lines were chosen and treated with CQ at different concentrations for 24 hours. Then MTT assay was applied to determine the proliferation, and prodium iodide (PI) staining assay was used to detect the cell death. The specific apoptosis was examined by Hochest 33342 staining, TUNEL staining and Western blotting (caspase-9). The autophagic function was explored by GFP-LC3 redistribution, Western blotting (LC3), and electron microscopy.Results： MTT assay revealed that the proliferation of hepatic carcinoma cells was significantly inhibited by using CQ for 24 hours. The PI-positive cells increased significantly after the treatment with CQ (≥20 μmol/L) . Hochest33342 staining assay showed karyopyknosis and karyorrhexis. Meanwhile, TUNEL positive cells significantly increased and caspase-9 was activated. However, there was no significant change in the number of PI-positive cells after the CQ treatment at concentrations of 5 μmol/L and 10 μmol/L. CQ treatment resulted in significant increase of GFP-LC3-positive cells and expression of LC3-II. When the caspase inhibitor Z-VAD-FMK and 3-MA or Atg5 siRNA were applied at the same time, 40 μmol/L CQ-induced MHCC97-L cell death was significantly inhibited.Conclusions： CQ can inhibit the autophagic degradation of hepatic carcinoma cells, and resulted in the accumulation of autophagosomes and autophagic proteins. High-dose CQ directly induces the death of hepatic carcinoma cells, and the death has both characteristics of apoptosis and autophagic death.

Key WordsAutophagy;Hepatocellular carcinoma;Apoptosis;Chloroquine

中圖分類號(hào)R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

基本項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81472219)

·論著·