張學明　丁海麥　席海燕　李斌　張晶晶　虞飛

摘要：為了在人乳腺腫瘤上皮細胞系中表達重組人膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（GDNF），本研究構建了牛β-casein基因啟動子驅動的重組人GDNF乳腺上皮細胞特異表達載體，用脂質體介導法將其導入人乳腺腫瘤上皮細胞系Bcap-37細胞中，經G418抗性篩選8～10 d后，分離穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白的轉染細胞，PCR鑒定轉基因細胞，用催乳素、胰島素及氫化可的松誘導培養(yǎng)轉基因細胞，RT-PCR和Western Blot檢測重組人GDNF的表達分泌。結果表明：重組人GDNF乳腺上皮細胞特異表達載體被成功構建，轉染Bcap-37細胞后，穩(wěn)定整合到細胞染色體中，轉基因細胞經激素誘導后能夠表達分泌糖基化的 GDNF，為高效制備與天然人GDNF蛋白結構完全一致的重組人GDNF蛋白用于帕金森病臨床治療研究奠定了基礎。

關鍵詞：人乳腺腫瘤上皮細胞系；生物反應器；膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子；表達載體；帕金森病

中圖分類號： Q789文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0016-04

收稿日期：2014-07-23

基金項目：國家自然科學基金（編號：31060304）；內蒙古高等學?？茖W研究項目（編號：NJ10184） 。

作者簡介：張學明（1970—），男，內蒙古包頭人，博士，副教授，主要研究方向為重組藥物蛋白。E-mail：byzhxm@126.com。帕金森病（Parkinsons disease，PD）是老年人群中常見的一種神經元退行性疾病，其臨床表現主要是以靜止性震顫、運動遲緩、肌僵直和姿勢平衡障礙為特征。PD的病理特征主要是中腦黑質多巴胺能神經元退行性喪失，導致紋狀體中多巴胺含量顯著降低[1]。目前用于PD臨床治療的常規(guī)藥物主要有復方左旋多巴、多巴胺受體激動劑、抗膽堿能藥物等，這些藥物能夠暫時減輕或緩解癥狀，但不能阻止PD的進程，且長期用于PD治療會出現多種并發(fā)癥[2]；因而，研制開發(fā)新的藥物用于PD的有效治療是非常必要的。

膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell line-direved neurotrophic factor，GDNF）是由Lin等于1993年在B49神經膠質瘤細胞中分離純化出的一種分泌性糖蛋白，屬于TGF-β超家族成員[3]。研究表明，GDNF對多巴胺能神經元具有營養(yǎng)及保護作用[4]，應用GDNF治療帕金森病已進入二期臨床研究[5]。然而由于GDNF在人和動物體中含量低，從動物組織中分離純化GDNF用于疾病動物模型和臨床實驗研究是不現實的；因而，應用轉基因技術大量生產重組GDNF用于疾病動物模型和臨床研究具有潛在的重大社會效益和經濟效益。

本研究構建了牛β-casein基因啟動子驅動的人GDNF基因乳腺上皮細胞高效特異表達載體，轉染人乳腺腫瘤上皮細胞系Bcap-37細胞，獲得了能夠表達重組人GDNF蛋白的轉基因Bcap-37細胞系，為高效制備與天然人GDNF蛋白結構完全一致的重組人GDNF蛋白，并將其用于帕金森病臨床治療的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

大腸桿菌DH5α、pP40R、pCMV-Red、pUC-gdnf為內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院醫(yī)學生物化學實驗室保存。

質粒提取試劑盒（QIAGEN公司）、小量RNA提取試劑盒（上海舜華生物工程有限公司）、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN公司）、DNA純化試劑盒（TIANGEN公司）。

Taq Plus、Pfu DNA聚合酶購自TIANGEN公司；T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、M-MLV反轉錄酶、Oligo（dt）、限制性內切酶均為TaKaRa產品。

人乳腺腫瘤上皮細胞系Bcap-37購自中國科學院上海細胞研究所；RPMI-1640、催乳素、氫化可的松、胰島素購自Sigma 公司；兔抗人多克隆GDNF抗體（Rabbit Polyclonal GDNF Antibody）購自Santa Cruz公司；連接了堿性磷酸酶的羊抗兔二抗（Goat Anti-rabbit Second Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase）及 BCIP/NBT 試劑盒購自博士德公司。

1.2試驗方法

1.2.1重組人gdnf乳腺特異表達載體的構建根據Bonsing等發(fā)表的牛β-casein基因序列（M55188）[6]設計PCR上游引物：5′-TCTGGGCCCGAAAAGGGAAATGTTGAATGGGAAG-3′，下游引物：5′-GGCCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA-3′，上下游引物兩端分別引入ApaⅠ和XhoⅠ 酶切位點。提取?；蚪MDNA，PCR擴增牛β-casein基因5′端上游包括啟動子、第1外顯子、第1內含子及部分第2外顯子的3.6 kb調控序列，經ApaⅠ/XhoⅠ雙酶切后插入到骨架載體pP40R[7]的ApaⅠ/XhoⅠ雙酶切位點作為gdnf cDNA乳腺特異表達的調控序列。XhoⅠ 酶切質粒pUC-gdnf獲得人gdnf cDNA基因插入到牛β-casein基因5′端3.6 kb調控序列下游的XhoⅠ位點。PCR檢測gdnf cDNA的插入方向，PCR上游引物設計在載體3.6 kb調控序列上，引物序列為5′-ACTATTTCCTCATCTTCCCATTCCCAG-3′，下游引物設計在gdnf cDNA序列上，引物序列為5′-GAGCTCCAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反應條件：94 ℃變性45 s，62 ℃復性45 s，72 ℃ 延伸1 min，共35個循環(huán)。正向插入將獲得598 bp的特異產物，反向插入則無特異性PCR產物。載體構建完成后，對載體與片段連接處、牛β-casein基因5′端調控序列核心區(qū)域進行測序。

1.2.2Bcap-37細胞的穩(wěn)定轉染與篩選用含20%胎牛血清（fetal calf serum，FBS） 的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)B-cap37細胞至70%～80%匯合時，消化細胞，以3×105個細胞/孔接種于6孔板。24 h后，按照脂質體Lipofectamine操作說明，每孔加入2.0 μg 線性化載體DNA轉染細胞。48 h后，消化每孔細胞接種于 100 mm 培養(yǎng)皿中，并加入濃度為300 μg/mL 的G418篩選8～10 d后，將表達紅色熒光蛋白的細胞克隆分離、擴培、冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR檢測穩(wěn)定轉染細胞提取穩(wěn)定轉染細胞基因組DNA，PCR檢測 gdnf cDNA是否整合到細胞基因組DNA中。PCR 上游引物：5′-GACCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3′，下游引物：5′-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反應條件為：94 ℃變性45 s，58 ℃ 復性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。

1.2.4轉基因細胞的誘導表達陽性轉基因細胞生長至80%匯合時，更換誘導培養(yǎng)基（RPMI-1640+4 μg/mL催乳素+10 μg/mL胰島素+1 μg/mL氫化可的松），分別誘導培養(yǎng)24、48 h 后，收集細胞及細胞培養(yǎng)上清液。

1.2.5RT-PCR分析gdnf的表達誘導培養(yǎng)的細胞按照RNA提取試劑盒操作說明提取RNA，以1.0 μg RNA為模板反轉錄合成cDNA第1鏈。以cDNA為模板PCR檢測轉基因細胞誘導培養(yǎng)后是否有 gdnf 在mRNA水平的表達。PCR引物、反應條件同“1.2.3”節(jié)。

1.2.6Western Blot 檢測 gdnf 的表達三氯乙酸法濃縮細胞誘導培養(yǎng)上清液，Lorry法測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封膜，一抗4 ℃過夜雜交，二抗室溫孵育1 h，BCIP/NBT顯色。

2結果與分析

2.1重組人gdnf乳腺特異表達載體的鑒定

載體物理圖譜見圖1，PCR檢測目的基因gdnf的插入方向見圖2。酶切鑒定gdnf 插入方向正確的載體，用ApaⅠ單酶切載體后，線性載體大小與預期大小（11 507 bp）相符；用XhoⅠ酶切載體能夠獲得預期的576 bp的目的基因 gdnf 片段；用ApaⅠ/XhoⅠ雙酶切載體能夠獲得預期的3.6 kb調控序列片段和576 bp目的基因gdnf 片段（圖3）。載體與片段連接處、牛β-casein基因5′端調控序列核心區(qū)域的測序結果正確（數據未顯示）。結果表明，本研究成功構建了以neo基因和DsRed2作為雙篩選因子、牛β-casein基因5′端調控序列驅動的重組人 gdnf 乳腺特異表達載體。

2.2轉基因細胞的鑒定

線性化載體轉染B-cap37細胞，G418篩選8～10 d 后，獲得了表達紅色熒光蛋白的細胞克?。▓D4）。分離擴培紅色熒光細胞，提取基因組DNA，PCR擴增重組人gdnf，發(fā)現未轉染細胞無特異條帶，而穩(wěn)定轉染的紅熒光細胞獲得了與預期一致的特異條帶（圖5），表明重組人gdnf已整合到細胞基因組之中。

2.3gdnf 基因的誘導表達

2.3.1RT-PCR檢測陽性轉基因細胞及未轉染細胞誘導培養(yǎng)24、48h后提取RNA，以RNA為模板PCR擴增 gdnf cDNA，無特異條帶產生，表明RNA未受基因組DNA污染；以RNA為模板反轉錄合成cDNA第1鏈，PCR擴增 gdnf cDNA基因，誘導培養(yǎng)24、48 h的轉基因細胞獲得了558 bp特異條帶，而陰性對照無特異條帶產生（圖6）。結果表明牛β-casein基因啟動子能夠驅動gdnf cDNA基因轉錄為mRNA。

2.3.2Western Blot檢測誘導培養(yǎng)48 h的轉基因細胞上清液經Western Blot探測，有大約15、18 ku 的2條特異帶形成，而未轉染細胞無特異帶形成（圖7），表明 gdnf cDNA基因能夠翻譯成蛋白，而且能進行翻譯后加工形成糖蛋白分泌到細胞外。

3結論與討論

當前，用于疾病動物模型和臨床研究的重組人GDNF是用轉基因大腸桿菌發(fā)酵制備的[8]。用大腸桿菌生產的重組人GDNF不能被糖基化[8]。臨床研究表明，糖基雖然對GDNF的神經營養(yǎng)功能不是必要的，但在帕金森病Ⅱ期臨床研究中，約有10%的病人由于重組人GDNF缺乏糖基化而產生了抗GDNF抗體的免疫反應[9]；因而，利用大腸桿菌生產重組蛋白雖然快速經濟，但該表達系統由于缺乏翻譯后修飾功能，而不適用于需要進行翻譯后修飾的重組蛋白的生產。而且，已有研究表明利用大腸桿菌生產的重組人GDNF由于蛋

白質的錯誤折疊而影響了其生物學功能[10]。也有研究者用昆蟲細胞和酵母菌制備重組人GDNF，這些低等真核細胞雖然可以表達糖基化的重組人GDNF，但其糖基化與天然的人GDNF的糖基化有差異[11-13]，從而在臨床研究中同樣存在安全問題。

當前，需要進行翻譯后修飾的重組蛋白大多用非人類的哺乳動物細胞進行表達[14]。用非人類的哺乳動物細胞可以表達與天然人蛋白結構一致的重組人蛋白，但也有時候存在差異[15]；因而在治療應用上，人們更希望利用人細胞系來生產與天然人蛋白結構完全一致的重組人蛋白[16]。

本研究將人gdnf cDNA插入到3.6 kb牛β-casein基因5′端調控序列下游，并用SV40 polyA序列作為其轉錄終止信號，構建了重組人 gdnf 乳腺特異表達載體。將其轉入人乳腺腫瘤細胞系Bcap-37中，獲得了隨機整合轉基因細胞，用激素誘導表達后在細胞上清液中檢測到了重組人GDNF蛋白。人GDNF蛋白為同源二聚體糖蛋白，單體糖蛋白18 ku，去糖基化單體約15 ku[17]。本研究從激素誘導的轉基因細胞上清液中通過Western Blot 探測到約15、18 ku的2條特異條帶，且重組人GDNF蛋白絕大部分為糖基化蛋白（圖7）。由于該重組蛋白是用人乳腺腫瘤細胞系作為反應器制備的，因而，我們推測在人乳腺腫瘤細胞系Bcap-37中表達的18 ku重組人GDNF蛋白與天然的人GDNF相比，在結構上應當沒有差異，如果用于臨床研究應當更具有安全性。本研究為高效制備與天然人GDNF蛋白結構完全一致的重組人GDNF蛋白用于帕金森病臨床治療研究奠定了基礎。

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