王 宇，黃 清，董明睿，劉尊敬

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與衰老密切相關(guān)、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力損傷為主要癥狀的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其主要病理改變?yōu)橐驭?淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑和tau 蛋白異常聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。近年來(lái)的研究表明AD 發(fā)病與炎癥密切相關(guān)，在AD 患者和動(dòng)物模型腦內(nèi)有大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞［1］。另外在AD 中晚期腦內(nèi)出現(xiàn)大量被Aβ 激活的膠質(zhì)細(xì)胞，并伴隨有炎癥因子表達(dá)的增加以及補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。

白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，以往的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇有抗血小板聚集、抗氧化、抗炎癥、抗衰老及預(yù)防腫瘤等作用［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有神經(jīng)保護(hù)作用?？擅黠@延緩神經(jīng)軸突變性［3］，抑制Aβ 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元的凋亡，改善AD 動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶障礙［4］。因此，白藜蘆醇在AD 的治療方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，然而，白藜蘆醇神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制并不清楚。有研究顯示白藜蘆醇對(duì)LPS 引起的小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥有抑制作用。基于神經(jīng)炎癥在AD 發(fā)病中的重要作用，本研究主要從抑制神經(jīng)炎癥的角度對(duì)白藜蘆醇治療AD 的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 小鼠側(cè)腦室注射Aβ 建立AD 模型 健康雄性清潔級(jí)ICR 小鼠，體重25～30 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。Aβ1-42(Sigma 公司)用無(wú)菌三蒸水配制成0.5 μg/μl，放入37 ℃孵位儀上，沿著中線切開頭部皮膚，暴露前囟和人字縫，用粗針頭在左側(cè)側(cè)腦室處鉆破頭骨，相對(duì)坐標(biāo)為前囟后2 mm，中線左側(cè)1.5 mm，硬腦膜下2.5 mm，向小鼠左側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ1-423 μl(1.5 μg)/只，在5 min內(nèi)注射完，停針10 min，然后緩慢拔出注射針，速度為1 mm/min，將適量青霉素粉末涂抹于傷口表面，然后用手術(shù)線將切口縫合，待小鼠清醒后放入籠中。假手術(shù)組大鼠于坐標(biāo)為前囟后2 mm，中線左側(cè)1.5 mm，硬腦膜下2.5 mm 處注射3 μl 無(wú)菌三蒸水。手術(shù)后，將側(cè)腦室注射Aβ1-42小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、白藜蘆醇給藥組，每組15 只小鼠。手術(shù)后第2 天灌胃給有小鼠白藜蘆醇50 mg/kg，假手術(shù)組和模型組給予同樣劑量的0.5%CMC-Na，每天一次，連續(xù)給藥18 d。實(shí)驗(yàn)中所有操作均遵循北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮裝置為一個(gè)直徑120 cm，水深40 cm，內(nèi)表面糊有一層黑紙的圓形水池(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，水溫23 ℃～25 ℃，室內(nèi)溫度控制在26 ℃～28 ℃。將水箱隨機(jī)分為四個(gè)象限，實(shí)驗(yàn)時(shí)平臺(tái)位置固定不變，置于第二象限中央，低于水面1～2 cm。室內(nèi)四周墻壁上做上明顯的標(biāo)記，以便小鼠能夠根據(jù)標(biāo)記辨認(rèn)方向。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中室內(nèi)所有物體的擺放位置同定，以免對(duì)小鼠產(chǎn)生干擾。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，每天進(jìn)行兩次。前5 d 為定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)，將小鼠面朝池壁隨機(jī)先后從兩個(gè)象限輕輕放入水中，避免應(yīng)激和將小鼠頭部浸入水中，同時(shí)記錄小鼠1 min內(nèi)找到安全平臺(tái)的潛伏期，并讓其在安全平臺(tái)上停留30 s，然后取出放回籠子。若小鼠120 s 內(nèi)未找到安全平臺(tái)，則潛伏期記為120 s。第6 天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去安全平臺(tái)，隨機(jī)選擇一個(gè)象限將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠120 s 內(nèi)的游泳軌跡。

1.3 海馬神經(jīng)元尼氏染色 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h 后，每組隨機(jī)選取5 只小鼠，用含3%蔗糖和4%多聚甲醛的PBS 溶液心臟灌流。然后斷頭取腦，放至含0%蔗糖和%多聚甲醛的PBS 固定液中放置24 h 以上至腦組織塊下沉。將固定好的腦組織置于液氮中直至全部變白。冰凍切片機(jī)預(yù)冷至-20 ℃，切片厚度為20 μm，直接貼片于載玻片上，在焦油固紫工作液中染色15～30 min，蒸餾水洗去浮色，依次置入70%、80%、95%酒精中分色，鏡下觀察尼氏顆粒清晰，然后切片入特殊分色液褪背景。酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡觀察尼氏染色情況。

1.4 ELISA 檢測(cè)海馬炎癥因子 小鼠于行為學(xué)測(cè)試24 h 后斷頭取海馬，用非變性裂解液提取海馬總蛋白。用ELISA 試劑盒(R＆D 公司)檢測(cè)TNFα 和IL-1β 的含量，按說(shuō)明書進(jìn)行操作，結(jié)果以pg/g濕組織表示。

1.5 Western blot 結(jié)果 小鼠斷頭取腦，分離海馬，用胞漿-胞核裂解液(北京普利萊公司)提取胞核蛋白。提取液離心后煮沸5 min。10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)移上蛋白的PVDF 膜在5%的TBST 配制的脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜，室溫下與TBST 稀釋的NF-κB一抗(Abcam 公司)孵育2 h，用TBST 洗3 遍。然后在TBST 稀釋的辣根過(guò)氧化酶偶連的二抗中孵育1.5 h，洗3 遍后，在LAS3000 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(日本富士公司)檢測(cè)，Gel-Pro Analyzer 4.0 分析條帶灰度。

1.6 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，不同組間的變化用One-Way ANOVA 分析，然后用LSD-SNK 檢驗(yàn)。P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)Aβ 側(cè)腦室注射所致學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用 小鼠側(cè)腦室注射Aβ 后找到平臺(tái)的潛伏期(P＜0.01)和穿越平臺(tái)的次數(shù)(P＜0.01)與假手術(shù)組小鼠相比明顯延長(zhǎng)，提示Aβ 造成小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙?？诜o予白藜蘆醇50 mg/kg，連續(xù)18 d，小鼠找到平臺(tái)的潛伏期與模型組小鼠相比時(shí)間明顯縮短(P＜0.05)(見(jiàn)圖1A)，穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯增多(P＜0.05)(見(jiàn)圖1B)，表明白藜蘆醇對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙有明顯的改善作用。

2.2 白藜蘆醇抑制小鼠海馬神經(jīng)元丟失 尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，存在于神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)，尼氏染色可反映神經(jīng)元的病變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ 側(cè)腦室注射后，與假手術(shù)組相比海馬神經(jīng)元有大量的尼氏體丟失，陽(yáng)性染色面積明顯降低(P＜0.01)，正常結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元呈灰白染色，正常形態(tài)被破壞。白藜蘆醇給藥后尼氏體陽(yáng)性染色面積與模型組相比明顯增加(P＜0.05)，神經(jīng)元損傷明顯減輕，細(xì)胞染色較深，存在正常形態(tài)(見(jiàn)圖2)。表明白藜蘆醇可減輕AD 模型神經(jīng)元的損傷。

2.3 白藜蘆醇抑制海馬TNF-α 和IL-1β 的產(chǎn)生 腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可產(chǎn)生并釋放多種炎癥因子，如TNF-α 和IL-1β 等，造成神經(jīng)元損傷、導(dǎo)致神經(jīng)功元功能障礙。結(jié)果顯示，Aβ 側(cè)腦室注射小鼠與假手術(shù)相比海馬TNF-α 和IL-1β 的量明顯提高(P＜0.01)，口服給予小鼠白藜蘆醇可明顯降低海馬TNF-α(P＜0.01)和IL-1β(P＜0.05)的量(見(jiàn)圖3)。以上結(jié)果表明白藜蘆醇對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用可能與其抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)。

2.4 白藜蘆醇通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路抑制神經(jīng)炎癥 NF-κB 是介導(dǎo)炎癥的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，被激活后，NF-κB p65 轉(zhuǎn)位入核，與特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件結(jié)合，引起多種細(xì)胞因子、趨化因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，教導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本結(jié)果顯示，小鼠側(cè)腦室注射Aβ 可引起NF-κB p65 轉(zhuǎn)位入核量明顯增加(P＜0.01)，口服白藜蘆醇可顯著降低NF-κB p65 轉(zhuǎn)位入核(P＜0.05)(見(jiàn)圖4)。推測(cè)白藜蘆醇通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路而抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

圖1 白藜蘆醇對(duì)Aβ 側(cè)腦室注射所致學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用

圖2 白藜蘆醇抑制小鼠海馬神經(jīng)元丟失

圖3 白藜蘆醇抑制海馬TNF-α 和IL-1β 的產(chǎn)生

圖4 白藜蘆醇抑制NF-κB 炎癥信號(hào)通路

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥在AD 發(fā)病中起著重要作用，是AD 的重要病理特征之一。AD 患者死亡后尸檢結(jié)果顯示，在其腦中Aβ 沉積部位聚集有大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞［5］。目前關(guān)于AD 發(fā)病機(jī)制的眾多假說(shuō)中，Aβ 和炎癥反應(yīng)相互促進(jìn)造成的神經(jīng)毒性被認(rèn)為是AD 發(fā)病過(guò)程中最重要的病理機(jī)制［6］。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠側(cè)腦室注射Aβ可引起明顯的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)在炎癥因子TNFα 和IL-1β 的產(chǎn)生和釋放明顯增加、炎癥信號(hào)通路NF-κB 激活，炎癥引起的神經(jīng)毒性導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的丟失，最終導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。白藜蘆醇灌胃給予小鼠可明顯抑制上述炎癥反應(yīng)和海馬神經(jīng)元的丟失以及小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，表明白藜蘆醇能改善AD 學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，作用機(jī)制可能與其抑制神經(jīng)炎癥有密切的關(guān)系。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞活化后可產(chǎn)生并釋放多種細(xì)胞因子，趨化因子和化學(xué)因子等毒性介質(zhì)，是造成神經(jīng)損傷、導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的主要因素，與AD 發(fā)病密切相關(guān)。TNF-α 主要由活化的膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)與神經(jīng)元上的TNF 受體-1 結(jié)合，激活膜內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［7］。IL-1β 主要由活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在高濃度時(shí)可使活化的膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生具有興奮性神經(jīng)毒性的谷氨酸，有直接的細(xì)胞毒作用。IL-1β 還可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，使其產(chǎn)生IL-6 等，形成惡性循環(huán)［8］。NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。NF-κB 是在膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子［9］，阻斷NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性可以明顯抑制NO、PGE2、TNF-α 和IL-1β 等炎癥因子的表達(dá)［10］。因此，對(duì)炎癥因子基因表達(dá)的抑制效應(yīng)通常被認(rèn)為是與NF-κB 活性的抑制有關(guān)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可明顯抑制海馬區(qū)TNF-α 和IL-1β的產(chǎn)生和釋放。值得一提的是白黎蘆醇可明顯抑制NF-κB p65 核轉(zhuǎn)位，從而抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活，表明白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抑制炎癥的作用。

海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡是AD 重要的神經(jīng)病理學(xué)特性，在AD 的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用［12］。在AD 患者腦中神經(jīng)元的丟失可能是Aβ 的毒性造成的，也可能是其作為蛋白大分子激活的膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)的神經(jīng)毒素引起的。腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞也對(duì)局部的損害因素發(fā)生反應(yīng)，增殖、活化并產(chǎn)生大量炎癥因子，從而啟動(dòng)并增強(qiáng)炎性反應(yīng)過(guò)程，加重神經(jīng)損傷［13］。本研究通過(guò)對(duì)小鼠海馬尼氏染色發(fā)現(xiàn)小鼠側(cè)腦室注射Aβ 后海馬神經(jīng)元明顯丟失，而當(dāng)用白藜蘆醇抑制神經(jīng)炎癥后海馬神經(jīng)元丟失就明顯降低，這與白藜蘆醇抑制Aβ 引起神經(jīng)炎癥有關(guān)。以上結(jié)果表明白藜蘆醇通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥而抑制神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，白藜蘆醇對(duì)AD 具有治療作用，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元有關(guān)。

［1］Yoo Y，Byun K，Kang T，et al.Amyloid-beta-activated uuman microglial cells through ER-resident proteins［J］.J Proteome Res，2015，14(1):214-223.

［2］Jang M，Cai L，Udeani GO，et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes［J］.Science，1997，275(5297):218-220.

［3］Araki T，Sasaki Y，Milbrandt J.Increased nuclear NAD biosynthesis and SIRT 1 activation prevent axonal degeneration［J］.Science，2004，305(5686):1010-1013.

［4］Lee YS，Kim HY，Kim Y，et al.Small molecules that protect against β-amyloid-induced cytotoxicity by inhibiting aggregation of β-amyloid［J］.Bioorg Med Chem，2012，20(16):4921-4935.

［5］Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer’s disease［J］.Lancet，2006，368(9533):387-403.

［6］Wisniewski T，Goui F.Immunotherapeutic approaches for Alzheimer’s disease［J］.Neuron，2015，85(6):1162-1176.

［7］Viviani B，Boraso M，Marchetti N，et al.Perspectives on neuroinflammation and excitotoxicity:a neurotoxic conspiracy［J］.Neurotoxicology，2014，43:10-20.

［8］Murta V，F(xiàn)aras MI，Pitossi FJ，et al.Chronic systemic IL-1β exacerbates central neuroinflammation independently of the blood-brain barrier integrity［J］.J Neuroimmunol，2015，278:30-43.

［9］Gao F，Ding B，Zhou L，et al.Magnesium sulfate provides neuroprotection in lipopolysaccharide-activated primary microglia by inhibiting NF-κB pathway［J］.J Surgical Research，2013，184(2):944-950.

［10］Lim JY，Sul D，Hwang BY，et al.Suppression of LPS-induced inflammatory responses by inflexanin B in BV2 microglial cell［J］.Can J Physiol Pharmacol，2013，91(2):141-148.

［11］Dang Y，Xu Y，Wu W，et al.Tetrandrine suppresses lipopolysaccharide-induced microglial activation by inhibiting NF-κB and ERK signaling pathways in BV2 cells［J］.PLoS One，2014，9(8):e102522.

［12］Zhang D，Wang Z，Sheng C，et al.Icariin Prevents Amyloid Beta-Induced Apoptosis via the PI3K/Akt Pathway in PC-12 Cells［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2015，2015:235-265.

［13］Dai XJ，Li N，Yu L，et al.Activation of BV2 microglia by lipopolysaccharide triggers an inflammatory reaction in PC12 cell apoptosisthrough a toll-like receptor 4-dependent pathway［J］.Cell Stress Chaperones，2015，20(2):321-331.