徐碧林，申甜，喻明，汪紅平，章志建，朱近悅

(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院，上海200062)

2型糖尿病(T2DM)以胰島素抵抗(IR)和胰島β細胞功能受損為特征。研究表明，高水平的β細胞凋亡是胰島功能受損的主要原因［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸(FFA)不僅參與IR的發(fā)生，也損害β細胞胰島素分泌功能，導(dǎo)致β細胞凋亡。白藜蘆醇(Res)屬于一種酚類植物抗毒素，是天然的抗氧化劑和自由基廓清劑，主要存在于各種紅葡萄果實和紅葡萄酒中。研究表明，Res具有明顯降糖作用，但具體機制尚未完全明了。2014年1～6月，本研究用FFA酸棕櫚酸處理β細胞后，觀察不同濃度的Res對胰島β細胞凋亡的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠胰島素瘤細胞(β-TC-6細胞株)購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所，Res、棕櫚酸購自上海安譜生物科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Biowest南美血源); AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(北北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，5%二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱(Shell-Lab公司)，流式細胞儀(BD FACSCALIBUR)。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代 原代β-TC-6細胞狀態(tài)良好，細胞密度80%～90%。準備完全培養(yǎng)基(DMEM高糖+15%FBS熱滅活)、PBS和胰酶。胰酶消化細胞，制備單細胞懸液。800 r/min離心3min，去除培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細胞。將細胞懸液按1∶2比例分到直徑10 cm培養(yǎng)皿中，補加培養(yǎng)基至10 mL。把培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔12～24 h，觀察細胞生長狀態(tài)。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)胰島細胞至對數(shù)生長期，接種于96孔板，每孔細胞數(shù)3×104。將細胞隨機分為A～F組，A、B組分別置于不含F(xiàn)FA及含500 μmol/ L棕櫚酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，C～F組分別置于含0.1、1、10、50 μmol/L的Res+棕櫚酸500 μmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每組設(shè)6個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，觀察細胞生長形態(tài)。

1.2.3 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)。各組細胞培養(yǎng)24 h后，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞，PBS洗滌細胞2次;1 000 r/min離心5min，離心2次后棄上清。每樣本加200 μL Binding Buffer重懸細胞后加入10 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻，置室溫避光孵育15 min;加入5 μL碘化丙啶，置相同條件下孵育5 min，1 h內(nèi)入流式細胞儀檢測凋亡細胞和正常細胞比率。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組胰島β細胞存活率、凋亡率比較，見表1。

表1 各組胰島β細胞存活率、凋亡率比較(%，s)

表1 各組胰島β細胞存活率、凋亡率比較(%，s)

注:與A組比較，*P＜0.05;與B組比較，#P＜0.01;與C組比較，△P＜0.01;與D組比較，○P＜0.01。

組別 n 細胞存活率 細胞凋亡率A組6 90.31±4.70 7.40±2.99 B組 6 5.07±2.27* 95.82±1.94* C組 6 8.37±2.06*# 83.36±2.06*# D組 6 21.99±2.47*#△ 68.94±2.19*#△E組 6 88.67±1.17*#△○ 11.03±1.08*#△○F組 6 5.20±1.72* 95.65±1.72*

3 討論

T2DM常合并血脂紊亂，脂代謝紊亂貫穿于T2DM發(fā)生、發(fā)展的始末，其與T2DM的關(guān)系得到廣泛的關(guān)注。國內(nèi)外眾多實驗都報道了脂毒性可引起β細胞功能紊亂及凋亡。所謂脂毒性是指血FFA水平升高后，超過脂肪組織的儲存能力和各組織對FFA的氧化能力，使過多的FFA以甘油三酯的形式在非脂肪組織過度沉積而造成該組織的損傷。FFA可通過多種途徑引起β細胞凋亡，如激活氧化應(yīng)激［2］、誘導(dǎo)凋亡相關(guān)因子(神經(jīng)酰胺［3］、Caspase家族［4］、凋亡相關(guān)蛋白激酶2［5］)失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［6］、以及microRNA等［7］。

Res是一種天然的多酚類化合物，存在于多種中草藥和其他植物中，如虎杖、葡萄、花生、桑葚、決明子、藜蘆等。諸多研究表明，Res具有多重生物活性作用，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎、心血管保護等。尤其近年來研究發(fā)現(xiàn)，Res還具有降低血糖，改善胰島素抵抗的作用，其具體機制目前還不是很明確。

本研究以FFA棕櫚酸和不同濃度Res同時作用于胰島β細胞，觀察β細胞凋亡及存活比例，以期探索Res對棕櫚酸誘導(dǎo)的β細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，Res在一定濃度范圍內(nèi)(0.1～10 μmol/L)可明顯抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的β細胞凋亡，且隨著濃度的增加，這種抑制作用也逐步增強。而當(dāng)濃度超過50 μmol/L時，Res抗凋亡作用消失。說明Res對胰島β細胞凋亡的抑制是在一定濃度范圍內(nèi)的，而高濃度的Res并不能抑制β細胞凋亡。Res的這種抗凋亡作用可能與其抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。研究表明，Res可顯著升高細胞線粒體錳超氧化物歧化酶的蛋白水平和活性，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用［8］。另外，Res還可通過直接清除活性氧或者抑制NADPH氧化酶的活性，保護細胞免受損傷［9］。高FFA水平也是糖尿病氧化應(yīng)激的直接來源之一。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能與FOX01降低密切相關(guān)。而Res可能通過激活SIRTI使FOX01活性升高，從而緩解FFA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷［10］。近年來的研究表明，Res還可通過抑制IKK-β/IκB/NF-κB炎癥信號通路［11］，激活 AMPK通路［12］、PI3K/Akt通路［13］等來發(fā)揮其降低血糖、改善胰島素抵抗的作用。但是，由于Res的作用機制復(fù)雜，不同濃度的Res可產(chǎn)生截然不同的作用，相同濃度的Res處理不同的細胞亦可產(chǎn)生不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Res劑量為0.01～1.00 μmol/L時，可改善細胞的胰島素敏感性，保護細胞功能［14］;而當(dāng)其劑量超過10 μmol/L且培養(yǎng)時間超過24 h可對細胞產(chǎn)生毒性作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L Res培養(yǎng)24 h可誘導(dǎo)細胞凋亡［15］。本研究的結(jié)果與之相似，其具體機制還有待進一步研究。

總之，本研究證實在一定濃度范圍內(nèi)，Res能顯著拮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島β細胞凋亡，從而為Res進一步應(yīng)用于糖尿病臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

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