黃穎，梁曉燕，李騁進(jìn)，胡軍，康曉莉

(陜西省人民醫(yī)院，西安710068)

隨著放射療法在腫瘤患者中的大量應(yīng)用，因放射所致組織細(xì)胞損傷備受關(guān)注，其中人造血干細(xì)胞(HPCs)最易受到輻射影響［1］。研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射可誘導(dǎo)HPCs產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，從而引起HPCs氧化應(yīng)激［2，5］，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生突變［3］，甚至發(fā)生癌變［4］。Nrf-2可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯出一些抗氧化物質(zhì)，對抗氧化應(yīng)激作用［6］。Caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中級聯(lián)反應(yīng)的啟動子，被證實參與電離輻射所致細(xì)胞凋亡過程［7，8］。人參皂苷作為人參內(nèi)主要的藥理活性成分［9］，具有很強(qiáng)的抗炎和抗氧化作用，可明顯抑制心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞在病理條件下發(fā)生的凋亡和氧化應(yīng)激［10，11］。目前，關(guān)于人參皂苷對電離輻射下HPCs的保護(hù)作用還未見報道。2014年1～11月，我們通過體外分離培養(yǎng)HPCs，觀察人參總皂苷對不同強(qiáng)度電離輻射下HPCs是否有一定保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶由美國Gibco公司提供;人參皂苷購自吉林省宏久生物技術(shù)股份有限公司;CD+34細(xì)胞選擇試劑盒、MTT試劑盒、AV/PI雙染試劑盒、ROS檢測試劑盒等購于上海碧云天生物科技有限公司;Caspase-3和Nrf-2的一抗和二抗購于武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPCs的分離培養(yǎng) 臍帶血由陜西省人民醫(yī)院檢驗科采集。供者要求:身體健康，發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦;無遺傳病史，無血液系統(tǒng)疾病，無寄生蟲及地方病;HIV、肝炎、梅毒等檢測均為陰性;供者知情同意。每次采集臍血50～120 mL。采用磁珠細(xì)胞分選免疫磁性吸附柱分離裝置，用CD+34細(xì)胞選擇試劑盒按說明分離與純化CD+34細(xì)胞，培養(yǎng)21 d。

1.2.2 HPCs電離輻射處理 將細(xì)胞以1×103接種于96孔板，隨機(jī)分為對照組和觀察組;對照組不處理，觀察組予以5.0 μmol/L人參皂苷0.2 mL/孔預(yù)處理24 h。兩組用直線加速器行X射線照射，劑量率為2.60 Gy/min，照射時間分別為0、23、46、115 s，輻射劑量分別為0、1、2、5 Gy。然后加入新鮮的培養(yǎng)基，37℃下置入5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 HPCs活性檢測 采用MTT法。按照操作說明書，先將1 mg/mL的MTT加入各組細(xì)胞內(nèi)，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3 h。倒掉培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，上酶標(biāo)儀于550 nm波長下測定各組細(xì)胞的吸光度，計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 ROS水平測定 電離輻射后24 h，每個樣本收集細(xì)胞約5×105;按照說明書向各實驗孔內(nèi)添加50 μmol H2DCFDA，37℃避光染色30 min。收集各孔內(nèi)細(xì)胞，用PBS液清洗后進(jìn)行重懸，上流式細(xì)胞儀檢測;調(diào)整激發(fā)波長至490 nm，發(fā)射波長為527 nm，用 CellQuest軟件以熒光相對強(qiáng)度表示 ROS水平。

1.2.5 Caspase-3和Nrf-2檢測 采用Western blot法。將各組細(xì)胞以1×106接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，按照每200萬細(xì)胞100 μL裂解液的比例加入裂解液提取細(xì)胞。取出所需測定的樣品，沸水中煮5 min使蛋白變性;置入0.5 mL的離心管內(nèi)，加入5×SDS的緩沖液。按照說明書對樣品進(jìn)行電泳、顯影，將膠片拍照，用Image Pro Plus對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。所得數(shù)據(jù)以s表示，采用t檢驗及方差分析。P≤ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較見表1。

表1 兩組細(xì)胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較(s)

表1 兩組細(xì)胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較(s)

注:與同組0 Gy比較，*P＜0.05;與對照組同輻射劑量比較，#P＜0.05。

組別 細(xì)胞存活率(%) ROS活性157±7.44觀察組0 Gy 96.48±5.04 136±6.66 1 Gy 93.35±4.48# 138±5.97# 2 Gy 91.33±4.05# 142±6.78# 5 Gy 89.15±4.22# 137±6.63#對照組0 Gy 97.23±5.12 140±6.68 1 Gy 82.05±4.19* 158±7.99* 2 Gy 74.54±3.57* 180±8.26* 5 Gy 61.07±3.69*

2.2 兩組細(xì)胞Caspase-3、Nrf-2表達(dá)比較 見表2。

表2 兩組細(xì)胞Caspase-3、Nrf-2表達(dá)比較(s)

表2 兩組細(xì)胞Caspase-3、Nrf-2表達(dá)比較(s)

注:與同組0 Gy比較，*P＜0.05;與對照組同輻射劑量比較，#P＜0.05。

組別Caspase-3 Nrf-2 1.21±0.04觀察組0 Gy 1.28±0.04 1.17±0.06 1 Gy 1.53±0.05*# 1.73±0.09*# 2 Gy 1.61±0.05*# 1.94±0.10*# 5 Gy 1.83±0.06*# 2.28±0.12*#對照組0 Gy 1.27±0.04 1.15±0.04 1 Gy 1.84±0.05* 1.24±0.04 2 Gy 1.96±0.06* 1.16±0.03 5 Gy 2.31±0.07*

3 討論

人的造血組織對電離輻射非常敏感。據(jù)報道，1～7 Gy的電離輻射均會誘導(dǎo)HPCs發(fā)生不同程度的損傷［12］，我們選取1～5 Gy進(jìn)行研究［13］。研究證實，5.0 μmol/L的人參皂苷抗氧化作用顯著［14］，所以我們以5.0 μmol/L人參皂苷做為實驗劑量。

本研究結(jié)果顯示，受到電離輻射的HPCs活性明顯下降，而且這種下降趨勢可被人參皂苷所抑制。我們知道，MTT是通過測定線粒體膜上的琥珀酸脫氫酶的活性來測定細(xì)胞活性的［15］，從而我們推斷，人參總皂苷的這種作用正是通過對線粒體產(chǎn)生保護(hù)作用實現(xiàn)的，而線粒體正是 ROS產(chǎn)生的主要場所［16］。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞經(jīng)輻射繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，大量細(xì)胞已經(jīng)死亡，但整體的ROS水平仍明顯高于對照組。其原因可能為殘存的細(xì)胞為避免發(fā)生凋亡繼續(xù)增殖，而增殖過程中可產(chǎn)生大量的ROS［17］。但是，5 Gy劑量電離輻射下，HPCs的ROS水平已經(jīng)基本持平，可能與高劑量的電離輻射激活某種抗氧化機(jī)制有關(guān)［18］。但是，當(dāng)我們用人參總皂苷處理HPCs后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低，從而減緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Caspase-3為半胱氨酸蛋白酶家族的一個重要成員，在細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著至關(guān)重要的作用。它是死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵啟動子，其活性增強(qiáng)一般說明細(xì)胞即將向凋亡進(jìn)展［20］。本研究顯示，電離輻射可誘導(dǎo) HPCs內(nèi)Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，而人參皂苷可有效抑制Caspase-3表達(dá)，這可能是人參皂苷抑制電離輻射誘導(dǎo)HPCs凋亡的一個作用機(jī)制。Nrf-2是一種與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它可以直接激活細(xì)胞內(nèi)含抗氧化基因的蛋白表達(dá)，從而起到對抗細(xì)胞氧化的作用［21］;另外，Nrf-2還可有效抑制各種病理狀態(tài)下引起的線粒體功能改變［22］。本結(jié)果顯示，在電離輻射的作用下，HPCs內(nèi)的Nrf-2蛋白隨著輻射增強(qiáng)呈下降趨勢，用人參皂苷處理后其表達(dá)增加，提示人參皂苷抗氧化作用可能與促進(jìn)Nrf-2表達(dá)有關(guān)。但是，人參皂苷含有Rb3、Rg1、Rf2、Rh2和Rd等多種活性成分，而其激活Nrf-2的表達(dá)到底是哪種單體起作用，需要進(jìn)一步研究。

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