高國(guó)平 鄧秋越 王紅 王月 謝皖豫 馬騰飛

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽(yáng)，110161)

地錦葉斑病病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性1)

高國(guó)平 鄧秋越 王紅 王月 謝皖豫 馬騰飛

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽(yáng)，110161)

結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)地錦(Parthenocissustricuspidata)葉斑病病原菌進(jìn)行了鑒定，并在室內(nèi)純培養(yǎng)條件下，采用生長(zhǎng)速率法研究了病原菌在不同培養(yǎng)基、pH值、溫度、光照、碳源和氮源條件下菌絲生長(zhǎng)和菌落形態(tài)。結(jié)果顯示：病原菌為馬卡假尾孢(PseudocercosporamacadamiaeDeighton)；病原菌生長(zhǎng)較適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和20%地錦植物煎汁的PDA培養(yǎng)基，適宜pH值為6.0～7.0，菌絲生長(zhǎng)適宜溫度范圍為25～30 ℃，最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母粉，最佳光照條件為全黑暗。

地錦；葉斑??；馬卡假尾孢；生物學(xué)特性

We identified the leaf spot fungus ofParthenocissustricuspidataby the means of combining the traditional morphological and molecular biological methods, and we studied the effects of medium, pH， temperature, light, carbon and nitrogen resources on mycelium growth and colony morphology by growth rate method. The pathogenic bacterium wasPseudocercosporamacadamiaeDeighton. The optimum medium for the mycelium growth was PDA medium and PDA medium withParthenocissustricuspidataextract. The optimum pH was 6-7, and the optimum temperature for mycelia growth was 25 ℃-30 ℃. The mycelium grew best on media with sucrose as carbon source, yeast as nitrogen resource and the optimum photoperiod was in darkness.

地錦(Parthenocissustricuspidata)，別名爬山虎，為葡萄科(Vitaceae)地錦屬(Parthenocissus)多年生大型落葉木質(zhì)藤本植物[1]，具有極強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性、耐旱性和吸附攀援能力，因而是具有觀賞性和裝飾性的園林綠化植物[2]。但近些年來(lái),在地錦葉片上常常發(fā)生一種葉斑病害，該病害能引起葉片葉斑、葉枯、早落，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值和生長(zhǎng)存活。國(guó)內(nèi)外對(duì)于該植物病害的研究報(bào)道較少，特別對(duì)病原菌生物學(xué)特性的研究也鮮有報(bào)道。本研究采用形態(tài)學(xué)和分子鑒定技術(shù)相結(jié)合的方法[3-4]，對(duì)地錦葉斑病病原菌進(jìn)行鑒定，并在室內(nèi)菌絲純培養(yǎng)條件下開(kāi)展了病原菌生物學(xué)特性試驗(yàn)，在理論上和實(shí)踐上對(duì)掌握該病原菌及其病害具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與鑒定

采樣與分離純化:從野外采集病癥明顯的地錦葉片，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無(wú)菌操作條件下采用組織分離法，將分離材料消毒后移至提前準(zhǔn)備好的PDA培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)分離純化后置于冰箱內(nèi)4 ℃保存?zhèn)溆肹5-6]。

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定:首先對(duì)病原菌子實(shí)體形態(tài)進(jìn)行觀察和描述，然后用常規(guī)切片鏡檢法制作病理切片，根據(jù)形態(tài)及孢子特征初步鑒定病原物種類[7-8]。

分子生物學(xué)鑒定:采用CTAB法提取基因組DNA[9]。用引物ITS1/ITS4對(duì)供試材料的rDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[10]。反應(yīng)體系為DNA模板1 μL，引物各2 μL，Master Mix 25 μL，加dd H2O至50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共設(shè)35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束以后各取2.5 μL產(chǎn)物電泳(1%瓊脂糖)檢測(cè)。目的片段回收方法參照TaKaRaAgaroseGelDNA PurificationKitVer.2.0切膠。序列測(cè)定工作由大連寶生物工程有限公司完成。將測(cè)得的ITS序列用GenBank中的BLAST序列比對(duì)工具進(jìn)行目的序列比對(duì)[11-12]。

1.2 生物學(xué)特性研究

用孔徑為0.6 cm的打孔器打取保存于PDA平板的菌落外緣菌餅，接種于供試培養(yǎng)基上，每個(gè)不同處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)4 d后采用生長(zhǎng)速率法十字交叉測(cè)量菌落直徑，求出凈生長(zhǎng)直徑(菌落直徑)[13]。

培養(yǎng)基：分別選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基、查式培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、地錦煎汁瓊脂培養(yǎng)基、20%地錦煎汁PDA培養(yǎng)基，將病原菌菌落接種于供試培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)[14]。

pH值：用調(diào)配好的HCL(1 mol·L-1)和NaOH(1 mol·L-1)調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH值[15]。pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。將病原菌菌落接種于不同pH值PDA培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。

溫度：將病原菌菌落接種于PDA培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)。

光照：將病原菌菌落接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫下全光照、12 h光照/12 h黑暗交替、全黑暗條件下培養(yǎng)。

碳源：以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配方，分別選擇蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、木糖、淀粉作為碳源制作培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)無(wú)碳培養(yǎng)基對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。

氮源：以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配方，分別選擇氯化銨、硝酸銨、酵母粉、甘氨酸、L-甲硫氨基酸、L-谷氨酸、蛋白胨、草酸銨為氮源，同時(shí)設(shè)無(wú)氮培養(yǎng)基對(duì)照，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 形態(tài)鑒定

斑點(diǎn)生于葉的正背兩面，近圓形至不規(guī)則形，直徑2.0～10.5 mm，常多斑愈合，初期僅為褐色小點(diǎn)，外具淺青黃色至淺黃褐色暈圈，后期葉面斑點(diǎn)褐色至黑褐色，葉背斑點(diǎn)褐色至深灰褐色。屬于無(wú)性型真菌。子實(shí)體葉兩面生，以生于葉背為主。菌絲體內(nèi)生。子座小，葉表皮下生，近球形，褐色至暗褐色，直徑15.0～40.0 μm(圖1A)。分生孢子梗多根緊密簇生，褐色至暗褐色，寬度不規(guī)則，向頂略變細(xì)，直立或稍彎曲(圖1B)。單生分生孢子梗青黃褐色，分生孢子倒棍棒-圓柱形，近無(wú)色至淺青黃色，直立至彎曲，頂部近尖細(xì)至鈍，基部倒圓錐形平截，3～15個(gè)隔膜，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有1至多個(gè)大小不等的油滴，孢子大小(31.0～90.0)μm×(3.0～8.0)μm(圖1C)。根據(jù)其形態(tài)特征，查閱國(guó)內(nèi)已有資料[16-17]，未見(jiàn)與該種形態(tài)完全相同的描述。但根據(jù)子座、分生孢子、分生孢子梗等特點(diǎn)，可確定為假尾孢菌屬(Pseudocercospora)的一個(gè)種。

A．發(fā)病癥狀；B.分生孢子梗形態(tài)；C.分生孢子形態(tài)。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示圖象清晰，條帶明顯。經(jīng)擴(kuò)增得到547 bp片段(圖2)。

測(cè)得菌株的ITS區(qū)段的DNA序列：

ATGATCGGGCTCGGCCCGATCCTCCCACCCTT

TGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGT

CCTCCGCGGCCGCCCCCCTCCCCGGGGGGGTGGCC

AGCGCCCGCCAGAGGACCATCAAACTCCAGTCAGT

AAACGATGCAGTCTGAAAAACATTTAATAAACTAA

AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA

TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA

TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC

ACATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTG

TTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGCTCTGCTTGGT

ATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGA

CCTCGGCGGTGGCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTAGA

ACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCC

GCCGGACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGAC

CTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGC

ATATCAAAATCGGGAGGAA

應(yīng)用以上測(cè)序結(jié)果在國(guó)際GenBank中進(jìn)行對(duì)比分析，從數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)到相似度100%的馬卡假尾孢菌(PseudocercosporamacadamiaeDeighton)，登錄號(hào)為EU541881。因此，在形態(tài)學(xué)鑒定描述的基礎(chǔ)上結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，最后確定地錦葉斑病病菌為馬卡假尾孢，為中國(guó)植物病害真菌新記錄種。

M．DL2000 DNA Marker；1.PCR產(chǎn)物。

2.2 病原菌的生物學(xué)特性

2.2.1 培養(yǎng)基

由表1可知，病原菌在不同培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。在查式培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、地錦煎汁瓊脂培養(yǎng)基和20%地錦煎汁PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度差異不顯著，但是病原菌在20%地錦煎汁PDA培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)生長(zhǎng)最好，其次為地錦煎汁瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。病原菌在燕麥片瓊脂培養(yǎng)基和玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度很快，但是菌絲纖細(xì)，結(jié)構(gòu)稀疏。麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度最慢并且菌絲極細(xì)而稀疏(圖3)。

表1 培養(yǎng)基對(duì)馬卡假尾孢菌絲生長(zhǎng)的影響

注:菌落直徑指培養(yǎng)4 d后凈生長(zhǎng)直徑，數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。同列數(shù)字后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

A.牛肉膏；B.查式；C.PDA；D.燕麥片；E.麥芽糖；F.地錦瓊脂；G.地錦PDA；H.玉米粉。

圖3 馬卡假尾孢在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.2.2 pH值

病原菌在pH=3.0～11.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)(表2、圖4)。在pH=4.0～8.0范圍內(nèi)均能快速生長(zhǎng)，但pH=6.0～7.0時(shí)菌落生長(zhǎng)最好，為最適生長(zhǎng)范圍。pH>7.0時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度呈減慢趨勢(shì)。病原菌在pH=3.0培養(yǎng)條件下的菌落直徑顯著大于pH=11.0的，可見(jiàn)，病原菌喜偏酸環(huán)境。

表2 pH值對(duì)馬卡假尾孢菌絲生長(zhǎng)的影響

注:菌落直徑指培養(yǎng)4 d后凈生長(zhǎng)直徑，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

A.pH=3；B.pH=4；C.pH=5；D.pH=6；E.pH=7；F.pH=8；G.pH=9；H.pH=10；I.pH=11。

圖4 不同pH培養(yǎng)條件下馬卡假尾孢的生長(zhǎng)情況

2.2.3 溫度

病原菌在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)(表3、圖5)。在25～30 ℃生長(zhǎng)較好且速度較快，為最適生長(zhǎng)溫度范圍；在溫度低于20 ℃和高于30 ℃，菌落生長(zhǎng)緩慢；病原菌在5 ℃低溫條件下的培養(yǎng)天數(shù)內(nèi)未見(jiàn)生長(zhǎng)，在35 ℃高溫條件下菌落日漸干癟，生長(zhǎng)停滯。

2.2.4 光照

病原菌在3種不同光照條件下均能快速生長(zhǎng)，但不同光照條件下菌落形態(tài)特征不同(表4、圖6)。在全黑暗條件下生長(zhǎng)速度最快且菌絲最為粗壯致密，全光照條件下菌絲纖細(xì)而稀疏，12 h光暗交替介于二者之間。

表3 溫度對(duì)馬卡假尾孢菌絲生長(zhǎng)的影響

注:菌落直徑指培養(yǎng)4 d后凈生長(zhǎng)直徑，其數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

A.5℃;B.10℃;C.15℃;D.20℃;E.25℃;F.30℃;G.35℃。

表4 光照條件對(duì)馬卡假尾孢菌絲生長(zhǎng)的影響

注:菌落直徑指培養(yǎng)4 d后凈生長(zhǎng)直徑，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

A.全黑暗;B.12 h光暗交替；C.全光照。

2.2.5 碳源

病原菌在7種不同碳源和無(wú)碳CK培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著(表5、圖7)。病原菌對(duì)蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖和乳糖利用較好，生長(zhǎng)速度較快，其中以對(duì)蔗糖的利用最好，生長(zhǎng)速度較快且菌落形態(tài)較好，所以蔗糖為最適碳源；在淀粉、木糖和無(wú)碳條件下生長(zhǎng)不佳，對(duì)木糖的利用最差。

2.2.6 氮源

病原菌在8種不同氮源和無(wú)氮條件下均能生長(zhǎng)(表6、圖8)。在L-谷氨酸、酵母粉和蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，其中L-谷氨酸生長(zhǎng)速度最快，但菌落形態(tài)沒(méi)有酵母粉粗壯致密，所以酵母粉為最適氮源；在草酸銨、氯化銨和硝酸銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)方面均差異不顯著；在L-甲硫氨基酸和無(wú)氮CK培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度很快，但是菌落極細(xì)并稀疏；對(duì)甘氨酸的利用效果最差。

表5 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

注:菌落直徑指培養(yǎng)4 d后凈生長(zhǎng)直徑，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

A.葡萄糖；B.乳糖；C.淀粉；D.無(wú)碳CK；E.麥芽糖；F.乳糖；G.果糖；H.木糖。

圖7 不同碳源培養(yǎng)條件下馬卡假尾孢的生長(zhǎng)情況

表6 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

注:菌落直徑指培養(yǎng)4 d后凈生長(zhǎng)直徑，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

A.酵母粉；B.蛋白胨；C.硝酸銨；D.無(wú)氮CK；E.甘氯酸；F.甲硫氨基酸；G.谷氨酸；H.草氨酸；I.氯化銨。

圖8 不同氮源培養(yǎng)條件下馬卡假尾孢的生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論

地錦葉斑病病菌為馬卡假尾孢，屬于假尾孢屬真菌，為中國(guó)植物病害真菌新記錄種。該病原菌在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為25～30 ℃，屬中高溫型菌種；較適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和加入地錦植物煎汁的PDA培養(yǎng)基；病原菌對(duì)多種不同碳源和氮源均能利用，最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母粉，在無(wú)碳、無(wú)氮培養(yǎng)基上也能微弱生長(zhǎng)；在pH=3.0～11.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，適宜pH值為6.0～7.0，為喜偏酸環(huán)境真菌；病原菌在不同光照條件下均能良好生長(zhǎng)，在全黑暗條件下生長(zhǎng)最快并最好。

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Pathogen Identification and Biological Characteristics of Creeper Leaf Spot

Gao Guoping, Deng Qiuyue, Wang Hong, Wang Yue, Xie Wanyu, Ma Tengfei(Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：112-116.

Parthenocissustricuspidata; Leaf spot；Pseudocercosporamacadamiae; Biological characteristics

1)遼寧省沈陽(yáng)市科學(xué)計(jì)劃資助項(xiàng)目(F11-107-3-00)。

高國(guó)平，男，1961年2月生，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：ggp8881@163.com。

2014年8月24日。

S763.15

責(zé)任編輯：程 紅。