高 霞，張 斌，王 斌 ，黃洪波，李新平

(1.武漢市第五醫(yī)院，湖北 武漢 430050；2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無錫 214000；3.無錫米度生物技術(shù)有限公司，江蘇 無錫 214000)

18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在LN229腦膠質(zhì)模型體內(nèi)生物分布和Micro-PET顯像

高 霞1，張 斌1，王 斌1，黃洪波2，李新平3

(1.武漢市第五醫(yī)院，湖北 武漢 430050；2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 無錫 214000；3.無錫米度生物技術(shù)有限公司，江蘇 無錫 214000)

為研究腫瘤顯像劑18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在LN229腦膠質(zhì)瘤模型裸鼠體內(nèi)分布和Micro-PET腫瘤顯像，采用酪氨酸和NOTA修飾的[c(RGDyK)]2為前體分別合成18F-FET和18F-RGD；顱內(nèi)注射LN229細(xì)胞建立腦膠質(zhì)瘤模型，研究18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在注射30 min和60 min體內(nèi)臟器分布以及荷瘤鼠Micro-PET顯像。結(jié)果表明，18F-FET和18F-RGD放化純度大于95%。荷瘤鼠體內(nèi)分布顯示，注射后1 h，18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在腦膠質(zhì)瘤和腦組織內(nèi)(括號(hào)內(nèi))的攝取分別為(4.89±0.65)%ID/g((2.72±0.76)%ID/g)、(2.10±0.32)%ID/g((0.23±0.01)%ID/g)、(3.02±0.64)%ID/g((0.74±0.12)%ID/g)，18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在腫瘤和腦攝取放射性比值分別為0.64±0.07(1.80±0.32)、8.22±1.03(9.13±1.21)和2.15±0.48(4.08±0.92)，Micro-PET腫瘤顯像清晰。結(jié)果提示，18F-FET和18F-RGD更適用于腦膠質(zhì)瘤的診斷。

腦膠質(zhì)瘤；Micro-PET顯像；O-(2-18F-氟代乙基)-L-酪氨酸

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，起源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，因其部位的特殊性及治療后容易復(fù)發(fā)，死亡率及致殘率均較高。腦膠質(zhì)瘤的分級(jí)不同其臨床表現(xiàn)、治療方法及預(yù)后均不相同，因此，在手術(shù)前做出明確診療十分重要[1]。電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)等影像學(xué)檢查雖然對膠質(zhì)瘤定位診斷有很好的價(jià)值，但定性診斷仍有欠缺。近年來，正電子發(fā)射斷層顯像(PET)被認(rèn)為是診斷腦膠質(zhì)瘤的有效手段，核素診斷因其利用了可以被惡性腫瘤特異性攝取的標(biāo)記化合物顯像，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，無創(chuàng)傷等特點(diǎn)越來越受到重視。但是不同的正電子顯像劑在腦膠質(zhì)瘤中分布顯像結(jié)果有很大的差異，選擇合適的顯像劑是診斷腦膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵，本研究建立原位腦膠質(zhì)瘤模型，通過18F-FDG、18F-FET和18F-RGD三種顯像劑進(jìn)行Micro-PET顯像和體內(nèi)分布，比較三種不同顯像劑在原位腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型中的體內(nèi)分布和Micro-PET腦膠質(zhì)瘤顯像效果。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人源性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(LN229)，購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c裸鼠，雄性，體重20～25 g，動(dòng)物購自上?？巳R斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。

1.1.3 試劑 氨基聚醚(K2.2.2)：美國Sigma公司；L-酪氨酸：百靈威化學(xué)試劑有限公司；異氟烷：美國 Minrad Inc公司；無水乙腈：百靈威化學(xué)試劑有限公司；乙二醇二對甲基苯磺酸酯：百靈威化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

醫(yī)用回旋加速器：日本住友重機(jī)械株式會(huì)社公司產(chǎn)品，HM-7型；Micro-PET掃描儀：德國Siemens公司產(chǎn)品，Inveon型；γ計(jì)數(shù)儀：美國鉑金埃爾默儀器有限公司產(chǎn)品，1 470wizard；活度計(jì)：德國PTW公司產(chǎn)品，CURIEMENTOR 3型。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 顯像劑合成

18F-FDG由無錫第四人民醫(yī)院提供；18F-FET顯像劑參考文獻(xiàn)方法[2]進(jìn)行合成，富集在QMA離子交換樹脂柱上的18F-離子用1 mL Kryptofix/K2CO3溶液洗脫至反應(yīng)瓶，通氮?dú)鈼l件下115 ℃蒸干，再加2 mL無水乙腈蒸干；加入8 mg乙二醇二對甲苯磺酸酯(溶于0.6 mL無水乙腈)，90 ℃反應(yīng)10 min。冷卻加入4 mL無水乙醚，過硅膠小分離柱，蒸除乙醚；反應(yīng)管中加8 mg酪氨酸二鈉、0.6 mL二甲基亞砜，90 ℃反應(yīng)10 min。加入1 mL無水乙醚，過硅膠小分離柱，用4 mL無水乙醚洗柱，吹干；再用3 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH為7.4)洗脫，收集洗脫液，過0.22 μm無菌濾膜，得到注射液，反應(yīng)式見圖1。通過高效液相色譜及其放射性檢測器檢測產(chǎn)品的放化純度。

圖1 18F-FET放射性合成反應(yīng)Fig.1 Radiosynthesis of 18F-FET

18F-RGD顯像劑參考文獻(xiàn)方法[3]進(jìn)行合成，標(biāo)記前體NOTA-PRGD2(32 μg)和1.6 μg氯化鋁經(jīng)200 μL乙醇溶解后，加入5%醋酸40 μL，混勻后加入30～100 μL新鮮制得的18F-離子，密閉100 ℃下反應(yīng)10 min，冷卻；加15 mL水稀釋后注入C18分離小柱，5 mL PBS和8 mL水沖洗柱子后用300 μL乙醇洗脫標(biāo)記產(chǎn)品，生理鹽水稀釋后無菌過濾即得18F-RGD注射液，通過高效液相色譜及其放射性檢測器檢測產(chǎn)品的放化純度。

圖2 18F-RGD放射性合成反應(yīng)式Fig.2 Radiosynthesis of 18F-RGD

2.2 LN229腦膠質(zhì)瘤模型

取對數(shù)生長期的LN229細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，離心去上清，然后用無血清培養(yǎng)基離心洗滌2次，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸浮于PBS中備用。裸鼠麻醉后，將其固定在立體定向儀上，剪去頭頂部眼裂至外耳道之間的毛發(fā)，常規(guī)消毒后于中線處眼裂后作一長約1 cm垂直切口，暴露前囟，取其前方1 mm，右側(cè)距中線1 mm處鉆孔，其直徑約為1 mm，接種腫瘤細(xì)胞。從恒溫水浴中取出配好的細(xì)胞懸液，以10 μL微量注射器吸取5 μL(含LN229細(xì)胞約為1×105個(gè))固定于電極移動(dòng)架上。調(diào)整移動(dòng)架位置，使針尖位于骨孔內(nèi)，緩慢垂直進(jìn)針2 mm，緩慢注入細(xì)胞懸液，注射完成后緩慢拔針。以骨蠟封閉骨窗，逐層縫合關(guān)顱，2周后可觀察到裸鼠消瘦，腦殼微微凸起，在組織分布實(shí)驗(yàn)中，取出裸鼠大腦，可發(fā)現(xiàn)腦部腫瘤和腦組織有明顯界限，分離正常腦組織和瘤組織[4]。

2.3 生物分布

LN229腦膠質(zhì)瘤裸鼠通過尾靜脈分別注射3.7 MBq(100 μCi)18F-FDG、18F-RGD和18F-FET ，在注射后30 min和60 min分別處死6只裸鼠，取腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉(骨骼肌)、脾、骨頭、腫瘤等感興趣臟器，所有樣品稱重后用γ計(jì)數(shù)儀測定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器的放射性計(jì)數(shù)占注入劑量的百分?jǐn)?shù)即放射性攝取率(%ID/g)。

2.4 Micro-PET掃描顯像

腦膠質(zhì)瘤裸鼠掃描前稱重，異氟烷麻醉，尾靜脈分別注射18F-FDG、18F-RGD和18F-FET 60 min后，俯位固定在掃描床上，靜態(tài)掃描10 min，18F-FDG掃描前需禁食12 h。

Micro-PET掃描顯像的參數(shù)：層厚0.78 mm，矩陣128*128，采集時(shí)間10 min，采集能窗350～650 keV。掃描采集結(jié)束后，將掃描的圖像用OSEM 3D迭代重建，迭代2次，重建后利用醫(yī)學(xué)分析軟件PMOD勾畫腦部為感興趣區(qū)域(ROI)，利用軟件可以實(shí)現(xiàn)腦部及腦膠質(zhì)瘤的勾畫，并得到相應(yīng)感興趣區(qū)域上放射性物質(zhì)攝取的平均值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 顯像劑合成

18F-FET總放化產(chǎn)率(未校正)為(26.5±1.5)%(n=4)，放化純度>95%，質(zhì)控結(jié)果示于圖3； 應(yīng)用手動(dòng)合成的18F-RGD，總放化產(chǎn)率(未校正)為(39.7±2.9)%(n=4)，放射性和紫外HPLC檢測表明，18F-RGD保留時(shí)間為14 min，放化純度>95%；質(zhì)控結(jié)果示于圖4。

圖3 18F-FET紫外吸收峰及放射性吸收峰Fig.3 The radiochemical purity of 18F-FET by HPLC and the UV absorption

3.2 生物分布

18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在LN229腦膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)分布結(jié)果見表1。18F-FDG、18F-RGD和18F-FET在血液中放射性由30 min時(shí)的(1.92±0.24)%ID/g、(0.45±0.12)%ID/g和(2.42±0.55)%ID/g下降到60 min時(shí)的(0.45±0.11)%ID/g、(0.17±0.02)%ID/g和(1.29±0.48)%ID/g，其他各組織臟器從30 min到60 min也都呈下降趨勢。

圖4 18F-RGD的紫外吸收峰及放射性吸收峰Fig.4 The radiochemical purity of 18F-RGD by HPLC and the UV absorption

表1 尾靜脈注射18F-FDG、18F-RGD和18F-FET后在LN229裸鼠體內(nèi)分布Table 1 Tissue distribution of radioactivity in glioma nude mice after intravenous injection of 18F-FDG, 18F-RGD and 18F-FET

腫瘤與肌肉放射性攝取比從30 min的6.83±1.09、5.51±0.92和4.38±0.92上升到60 min的8.23±1.73、7.72±0.87和4.79±1.12；腫瘤與腦攝取比從30 min的0.64±0.07、8.22±1.03和2.15±0.48上升到60 min的1.80±0.32、9.13±1.21和4.08±0.92。

3.3 Micro-PET掃描結(jié)果

LN229腦膠質(zhì)瘤模型通過三種不同顯像劑18F-FDG、18F-RGD和18F-FET進(jìn)行Micro-PET掃描，掃描結(jié)果示于圖7。18F-FDG掃描發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤部位腫瘤攝取清晰，同時(shí)其他正常腦組織部位攝取也比較高；18F-RGD掃描圖可見，腦膠質(zhì)瘤部位攝取明顯，腦部攝取很低；18F-FET掃描圖中可見，腫瘤攝取明顯，正常腦部攝取較低，腫瘤和正常腦組織有明顯界限。

a，b，c分別為不同顯像劑18F-FDG、18F-RGD和18F-FET掃描圖片；1，2，3分別為矢狀位、冠狀位和橫狀位，白色箭頭所指位置為腫瘤圖7 18F-FDG、18F-RGD和18F-FET Micro-PET 掃描圖Fig.7 Micro-PET imaging of 18F-FDG,18F-RGD and 18F-FET

4 討論

18F-FDG體內(nèi)分布顯示，雖然腫瘤/肌肉放射性攝取比達(dá)到30 min 6.83±1.09和60 min 8.23±1.73，但腫瘤/腦僅為30 min 0.64±0.07和60 min 1.80±0.32，并且從Micro-PET掃描圖像上很難確定腫瘤與正常腦組織的區(qū)分界線，主要因?yàn)?8F-FDG不是特異性的顯像劑，在炎癥組織中也同樣表現(xiàn)為攝取增高，而且由于腦組織能量來源于葡萄糖，所以18F-FDG 在正常腦組織內(nèi)大量積聚，PET圖像本底高，導(dǎo)致病灶與周圍正常腦組織對比差異小，不利于腦內(nèi)腫瘤的顯示及診斷。

18F-RGD和18F-FET體內(nèi)分布腫瘤/腦放射性攝取比分別達(dá)到30 min 8.22±1.03、2.15±0.48和60 min 9.13±1.21、4.08±0.92，而且Micro-PET掃描結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤對18F-RGD、18F-FET都有很高的攝取，顯像清晰界限明顯[5-6]，有助于18F-RGD、18F-FET對腦膠質(zhì)瘤的鑒別診斷[7]。主要是因?yàn)?8F-RGD可以與腫瘤中αvβ3受體特異性結(jié)合，18F-FET作為氨基酸PET顯像劑，臨床研究表明，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)在各種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中增加，18F-FET顯影劑在低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中顯示活性，且不依賴于破壞血腦屏障。

綜上所述，18F-FDG、18F-RGD和18F-FET均可對腦膠質(zhì)瘤裸鼠模型進(jìn)行顯像，但以具有特異性顯像的18F-RGD和18F-FET顯像效果更佳，能使腫瘤與腦組織界限更清晰，適于臨床腦膠質(zhì)瘤鑒別診斷和愈后觀察。

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Biodistribution and Micro-PET Imaging of18F-FDG、18F-RGD and18F-FET in LN229 Glioma Model

GAO Xia1, ZHANG Bin1, WANG Bin1, HUANG Hong-bo2, LI Xin-ping3

(1.TheFifthHospitalofWuhanCity,Wuhan430050,China; 2.JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Wuxi214000,China; 3.WuxiMolecularImagingCROCO.,LTD.,Wuxi214000,China)

Biodistributions of micro-PET tracer18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET in the LN229 induced glioma nude mice were performed using micro-PET technology. Tyrosine and NOTA modified [c(RGDyK)]2were employed as precursors for the synthesis of18F-FET and18F-RGD. Glioma model was established via intracerebral injection of LN229 cells and the biodistribution in tumor and major organs at 30 min and 60 min postinjection of18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET were determined by Gamma counting, respectively. The results showed more than 98% purity for18F-FET and18F-RGD. After 60 min injection of three radiotracers, the uptake values of18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET in tumor and brain were 4.89±0.65%ID/g ((2.72±0.76)%ID/g), 2.10±0.32%ID/g ((0.23±0.01)%ID/g), and 3.02±0.64%ID/g ((0.74±0.12)%ID/g), respectively. In addition, the ratio of tumor to brain of18F-FDG,18F-RGD, and18F-FET were determined as 0.64±0.07(1.80±0.32)、 8.22±1.03(9.13±1.21) and 2.15±0.48(4.08±0.92). Micro-PET imaging also represented a clearly visualized tumor circumscription. In conclusion, micro-PET combined with18F-FET and18F-RGD could be a promising technique for the diagnosis and research of glioma.

glioma tumor; Micro-PET imaging; O-(2-18F-fluoroethyl)-L-tyrosine

10.7538/tws.2015.28.03.0155

2014-00-00;

2014-00-00

江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所開放課題(KF2011066)；江蘇省創(chuàng)新基金( BC2012043)

高 霞(1980—)，女，武漢人，主治醫(yī)師，腫瘤學(xué)專業(yè)

張 斌，主治醫(yī)生，E-mail: 13329737428@163.com

TL92+3

A

1000-7512(2015)03-0155-05