孫祥敏，張 云，張 先，楊薇薇，蔡海燕

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.上海?？怪嗅t(yī)藥科技發(fā)展有限公司，上海 201318)

碘[131I]愛克妥昔單抗注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立

孫祥敏1，張 云1，張 先1，楊薇薇2，蔡海燕2

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.上海?？怪嗅t(yī)藥科技發(fā)展有限公司，上海 201318)

為建立碘[131I]愛克妥昔單抗注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，采用《中國藥典》二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，將供試品稀釋10倍、20倍、40倍進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均存在干擾；對供試品稀釋80倍進(jìn)行檢查或采用抗增液復(fù)溶鱟試劑，再將供試品稀釋20倍進(jìn)行檢查，均無干擾。供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查可采用將供試品至少稀釋80倍進(jìn)行檢驗(yàn)的方法；也可采用抗增液復(fù)溶鱟試劑，將供試品稀釋至少20倍進(jìn)行檢查。結(jié)果表明，直接稀釋法為產(chǎn)品檢驗(yàn)的首選方法。

碘[131I]愛克妥昔單抗注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；干擾實(shí)驗(yàn)

碘[131I]愛克妥昔單抗注射液，為放射性核素碘[131I]標(biāo)記的愛克妥昔單抗，是碘[131I]與愛克妥昔單抗共價偶聯(lián)的衍生物。該藥物約含1 g/L的愛克妥昔單抗、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液和20 g/L的人血白蛋白，放射性活度約為3.33 GBq，主要用于治療癌胚抗原表達(dá)陽性的大腸癌，是研究開發(fā)的新藥品種。該藥是注射劑，根據(jù)藥典規(guī)定[1]應(yīng)該對其進(jìn)行注射劑項(xiàng)下的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。該藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查采用凝膠法，在進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)前，需進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，確定適宜的檢驗(yàn)方法，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。擬對該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法進(jìn)行研究，建立無干擾的、適宜于該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

TAL-40D型試管恒溫儀:湛江安度斯生物有限公司；XW-80A型旋渦混合器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 主要材料

碘[131I]愛克妥昔單抗注射液：上海?？怪嗅t(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品： 每支120 EU，中國食品藥品檢定研究院提供；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品；鱟試劑：0.25 EU/mL，0.125 EU/mL，0.06 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品；抗增液：湛江安度斯生物有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 限值(L)的確定[2]

按公式L=K/M 計(jì)算。 K為每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)；M為每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重按60 kg計(jì)算，注射時間不足1 h，按1 h計(jì)算。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用1 mL BET水復(fù)溶后,在旋渦混合器上混勻15 min，然后逐級稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為2λ、λ、0.5λ、0.25λ，λ為鱟試劑靈敏度標(biāo)示值)，每步稀釋均在旋渦混合器上混勻30 s，使其在使用前充分分散。

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核

取18支鱟試劑，其中16支分別用0.1 mL BET水復(fù)溶，然后分別加入0.1 mL濃度為2λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行做4支；剩余2支，每支加入0.2 mL BET水，作為陰性對照(NC)。37±1 ℃恒溫培養(yǎng)60±2 min。若2λ管均為陽性(+)，0.25λ管均為陰性(-)，NC均為(-)時，實(shí)驗(yàn)有效。計(jì)算鱟試劑靈敏度測定值λc=antilg(∑X/4)(X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值)。λc在0.5λ～2λ范圍內(nèi)時，該批鱟試劑符合規(guī)定，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

2.4 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)計(jì)算

實(shí)驗(yàn)中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)由公式MVD=cL/λ計(jì)算得出，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測。c為供試品溶液濃度，當(dāng)L以EU/mL表示時，c為1.0 mL/mL。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

按《中國藥典》2010 年版二部附錄(ⅪE)-細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[2]進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。供試品溶液組(A)平行兩管，每管用0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；干擾實(shí)驗(yàn)系列(B)，每管用0.1 mL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(共四個濃度2λ、λ、0.5λ、0.25λ)復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液，每個濃度平行四管；鱟試劑標(biāo)示靈敏度對照系列(C)同靈敏度復(fù)核內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列；陰性對照組(D)平行兩管，每管加入0.2 mL BET水。37 ℃±1 ℃恒溫培養(yǎng)60±2 min。當(dāng)A、D均為(-)，C組在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時，實(shí)驗(yàn)有效。計(jì)算Es=antilg(∑Xs/4)，Et=antilg(∑Xt/4)(Xs為系列溶液C反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值，Xt系列溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值)。Es在0.5～2 λ范圍內(nèi)，Et在0.5Es～2Es范圍內(nèi)，供試品在該濃度下無干擾。如有干擾，采用有效的去除干擾方式重新實(shí)驗(yàn)。

2.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

采用建立好的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法對碘[131I]愛克妥昔單抗注射液進(jìn)行檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為供試品組、陽性對照組、供試品陽性對照組、陰性對照組，每組平行兩管。供試品組每管用0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；陽性對照組，每管用0.1 mL BET水復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL濃度為2λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；供試品陽性對照組，每管用0.1 mL濃度為2λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶鱟試劑，然后加入0.1 mL供試品溶液；陰性對照組每管加入0.2 mLBET水。37±1 ℃恒溫培養(yǎng)60±2 min。陰性對照組均為(-)，陽性對照組和供試品陽性對照組均為(+)，實(shí)驗(yàn)有效；供試品組均為(-)時，判定供試品符合規(guī)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 限值(L)的確定

碘[131I]愛克妥昔單抗注射液為無菌水針制劑，每瓶約4.0 mL。臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃給藥方案為：加入100 mL生理鹽水建立靜脈通道后滴注，30±10 min內(nèi)滴完，計(jì)算 M=4 mL/(60 kg·h)；放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，計(jì)算L=K/M=37.5 EU/mL。為了嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，保障用藥安全，上海?？怪嗅t(yī)藥科技發(fā)展有限公司企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)將L定為5 EU/mL。

3.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核

對3批不同批號和規(guī)格的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。3批鱟試劑靈敏度測定值(λc)均在0.5～2.0λ范圍內(nèi)，鱟試劑靈敏度復(fù)核均符合規(guī)定。

3.3 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)

碘[131I]愛克妥昔注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為5 EU/mL，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03 EU/mL，鱟試劑的靈敏度越高，相應(yīng)的MVD越大。當(dāng)使用不同規(guī)格鱟試劑時所對應(yīng)的最大有效稀釋倍數(shù)見表2。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核Table 1 Confirmation of the labelled lysate sensitivity

表2 最大有效稀釋倍數(shù)Table 2 The maximum valid dilution

3.4 干擾實(shí)驗(yàn)

為盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實(shí)驗(yàn)造成陽性影響[3]，首先選用較低靈敏度的鱟試劑。選λ為0.25 EU/mL的鱟試劑，供試品用BET水稀釋10倍、20倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 10倍、20倍稀釋液干擾實(shí)驗(yàn)Table 3 The test for interfering factors at 10 times and 20 times dilution

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Es在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，Et均小于0.5Es，供試品在10、20倍稀釋濃度下均存在干擾，且為增強(qiáng)作用。

采用兩種方法去除干擾，直接稀釋法和抗增液法。直接稀釋法將供試品進(jìn)行更高倍數(shù)稀釋，抗增液法實(shí)驗(yàn)過程中以抗增液替代檢查用水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4和表5。

直接稀釋法中，首先選用λ為0.125 EU/mL的鱟試劑，將供試品稀釋40倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Es在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，Et小于0.5Es，實(shí)驗(yàn)存在干擾，為增強(qiáng)作用；選用λ為0.06 EU/mL的鱟試劑，將供試品稀釋80倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，Es在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，三批供試品的Et均在0.5Es～2Es范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)均無干擾。

表4 直接稀釋法干擾實(shí)驗(yàn)Table 4 The test for interfering factors using a greater dilution

表5 抗增液法干擾實(shí)驗(yàn)Table 5 The test for interfering factors using the endotoxin-specific buffer

采用抗增液法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將供試品稀釋20倍時，Es在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，三批供試品的Et均在0.5Es～2Es范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)均無干擾。

直接稀釋法和抗增液法均可有效去除干擾。直接稀釋法操作簡單方便、且比較經(jīng)濟(jì)，推薦為碘[131I]愛克妥昔注射液常規(guī)檢驗(yàn)的首選方法。

3.5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

采用直接稀釋法，選λ為0.06 EU/mL的鱟試劑，將供試品稀釋80倍進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。4批次碘[131I]愛克妥昔注射液的檢驗(yàn)結(jié)果見表6，結(jié)果均符合規(guī)定。

表6 碘[131I]愛克妥昔單抗注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查Table 6 The bacterial endotoxin test of Iodine[131I] Actuximab Injection

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：4個批次的碘[131I]愛克妥昔注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定，細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于5 EU/mL。

4 小結(jié)

碘[131I]愛克妥昔單抗注射液為放射性藥品，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查主要采用凝膠法。鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)易受很多因素影響，碘[131I]愛克妥昔單抗注射液中含有人血白蛋白，人血白蛋白可激活鱟試劑的G因子旁路反應(yīng)，使檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性。當(dāng)存在干擾時可通過直接稀釋法、抗增液、特異性鱟試劑等[4]多種方法去除干擾。

當(dāng)采用直接稀釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，將供試品稀釋10、20、40倍均存在干擾，稀釋80倍無干擾?？梢圆捎脤⒐┰嚻分辽傧♂?0倍，進(jìn)行碘[131I]愛克妥昔單抗注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

抗增液主要是通過添加過量的真菌多糖來阻斷G因子旁路反應(yīng)，消除干擾。采用抗增液法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，將供試品稀釋20倍即無干擾?？梢圆捎脤⒐┰嚻分辽傧♂?0倍，以抗增液替代檢查用水復(fù)溶鱟試劑，進(jìn)行碘[131I]愛克妥昔單抗注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

直接稀釋法和抗增液法均可有效去除干擾。直接稀釋法操作簡單方便、且比較經(jīng)濟(jì)，推薦為碘[131I]愛克妥昔注射液常規(guī)檢驗(yàn)的首選方法。采用直接稀釋法對4批供試品檢驗(yàn)均符合規(guī)定，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

本研究建立了碘[131I]愛克妥昔單抗注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)、對產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制，同時也為新藥的申報(bào)工作提供相關(guān)資料和數(shù)據(jù)支持。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄6～7.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99～102.

[3] 中國藥品生物制品檢定所. 中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:310-325.

[4] 肖貴南，孫清萍，盛英美. 如何建立新藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(32)：159-162.

Xiao Guinan, Sun Qingping, Sheng Yingmei. How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs[J]. China Medical Herald, 2011, 8(32): 159-162(in Chinese).

Establishment of Bacterial Endotoxin Test of Iodine [131I] Actuximab Injection

SUN Xiang-min1, ZHANG Yun1, ZHANG Xian1, YANG Wei-wei2, CAI Hai-yan2

(1.HTACO.,LTD.,Beijing102413,China;2.ShanghaiHaikangPharmaceuticalTech. &Deve.Co.,Ltd,Shanghai201318,China)

To establish a method for the bacterial endotoxin test of Iodine [131I] Actuximab Injection,The experiment was carried out according to the appendix ⅪE in Vol.Ⅱ of the 2010 version of Chinese Pharmacopoeia. The results demonstrated that the preparation interfered with the test at 10 times, 20 times and 40 times dilution,and the interference can be eliminated after the sample was diluted to 80 times or the sample was diluted to 20 times with the endotoxin-specific buffer dissolving the Tachypleus Amebocyte Lysate. Two methods can be used to test the bacterial endotoxin of Iodine [131I] Actuximab Injection. One is the sample should be diluted to atleast 80 times,the other is the sample was diluted to 20 times with the endotoxin-specific buffer dissolving the Tachypleus Amebocyte Lysate. The dilution method is the preferred method for the quality control.

iodine [131I] actuximab injection; bacterial endotoxin test; interference test

10.7538/tws.2015.28.03.0135

2015-03-06;

2015-04-16

孫祥敏(1984—)，女，河南人，工程師，主要從事藥品檢驗(yàn)工作

TL92+3

A

1000-7512(2015)03-0135-05