張錦明，陳征宇，武向峰，張曉軍，朱 華，周 明，楊 志

(1.解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2.總后勤部衛(wèi)生部藥品器材局，北京 100842；3.解放軍總后藥品檢驗(yàn)所，北京 100071；4.北京腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100036)

分光光度計(jì)法測量氨基聚醚的專屬性

張錦明1，陳征宇2，武向峰3，張曉軍1，朱 華4，周 明1，楊 志4

(1.解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2.總后勤部衛(wèi)生部藥品器材局，北京 100842；3.解放軍總后藥品檢驗(yàn)所，北京 100071；4.北京腫瘤醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100036)

氨基聚醚(K2.2.2)含量是18F-FDG質(zhì)控中的關(guān)鍵指標(biāo)，比較了兩種常用測量K2.2.2方法的專屬性。分別采用分光光度計(jì)和半定量TLC 碘顯色法測量了14個樣品，其中9個陰性樣品、2個陽性樣品和3個供試品，并與LC-MS/MS測量對比。結(jié)果顯示：9個陰性樣品經(jīng)分光光度計(jì)法測量均為陽性，K2.2.2的測量結(jié)果在6.7～470.0 μg/mL；2個陽性樣品結(jié)果偏高(53，73 μg/mL)，3個供試品的K2.2.2含量在14.3～19.2 μg/mL；半定量TLC 碘顯色法測量9個陰性樣品結(jié)果為陰性,2個陽性樣品半定量結(jié)果與實(shí)際一致,3個供試品的K2.2.2含量低于10 μg/mL;LC-MS/MS法測量的14個樣品的結(jié)果與半定量TLC 碘顯色法的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，半定量TLC 碘顯色法測量K2.2.2的專屬性較好，適用于測量18F-FDG溶液中K2.2.2含量。

分光光度計(jì)法；氨基聚醚；TLC；液質(zhì)聯(lián)用；專屬性

氟-18標(biāo)記的正電子放射性藥品質(zhì)量控制的一個關(guān)鍵指標(biāo)為氨基聚醚(K2.2.2)含量，為了方便、準(zhǔn)確測量K2.2.2的含量，文獻(xiàn)報道了多種測量K2.2.2的方法[1-3]。美國和歐洲的藥典規(guī)定18F-FDG中K2.2.2含量不高于50 μg/mL，測量方法為半定量TLC 碘顯色法，我國藥典2014年5月20日關(guān)于18F-FDG國家標(biāo)準(zhǔn)草案中K2.2.2含量不高于25 μg/mL，測量方法為紫外分光光度計(jì)法[4]。本研究為證實(shí)紫外分光光度計(jì)法的專屬性，選擇了陰性樣品(加入了制備18F-FDG過程中可能存在的其他雜質(zhì)和輔料),陽性樣本(K2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液)和供試品(18F-FDG注射液)進(jìn)行測量，與半定量TLC 碘顯色法比較，測量結(jié)果經(jīng)LC-MS/MS證實(shí)[5]，以驗(yàn)證半定量TLC 碘顯色法和分光光度計(jì)法的專屬性。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑與設(shè)備

K2.2.2和三氟甘露糖,AR：江蘇華益科技有限公司;無水乙腈,AR：美國Aldrich公司;SEP-PAK C-18柱,SEP-PAK Al2O3柱：美國Waters公司;IC-H柱：美國Alltech公司;Dowex-50樹脂：美國Bio-Rad公司;碘：Sigma 公司；18F-FDG注射液原液,按文獻(xiàn)方法[6]純化和制備。

Nanodrop2000：美國 Thermo Scientific公司；TLC顯色缸：自制;TLC板：Flexible Plates For TLC,PE SIL G/UV,Whatman，裁成5 mm×100 mm備用;API 2000 LC-MS/MS串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀：美國ABI Sciex公司；Sony α200(1 020萬像素)：日本Sony公司。

1.2 測量樣本

14個被測試樣品(均在解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科制備)，其中有9個陰性樣本，2個陽性樣品，3批供試品。

(1) 陰性樣本

2號樣品:10 mL,先用12 mL注射用水洗IC-H柱,再10 mL注射用水流經(jīng)該柱后收集液；3號樣品:2 mL,2 mL注射用水流經(jīng)IC-H柱后收集液；5號樣品:10 mL,等體積的0.5 mol/L檸檬酸鈉溶液與0.5 mol/L NaOH混和液;6號樣品:10 mL注射用水;10號樣品:10 mL, 先用2 mL注射用水洗IC-H柱,再10 mL注射用水流經(jīng)該柱后收集液；11號樣品:10 mL,自行稱取得Dowex-50 1.5 g裝于空柱殼中, 取10 mL注射用水流經(jīng)該Dowex-50柱 后的收集液；12號樣品:10 mL,10 mL注射用水流經(jīng)Al2O3柱后收集液；13號樣品:10 mL,10 mL注射用水流經(jīng)C-18柱后收集液；14號樣品:10 mL,取20 g三氟甘露糖(華益),用2 mL乙腈溶解,再加入8 mL水。

(2) 2個陽性樣品

8號樣品:10 mL,標(biāo)準(zhǔn)K2.2.2溶液的濃度為30.0 μg/mL；9號樣品:10 mL,標(biāo)準(zhǔn)K2.2.2溶液的濃度為10.0 μg/mL。

(3) 3批供試品

取3批18F-FDG注射液原液，在制備一周內(nèi)經(jīng)衰變后測量，分別為4號(20140722)、7號(20140723)和15號(20140722P)。

1.3 測量方法

1.3.1 紫外分光光度計(jì)法 配制標(biāo)準(zhǔn)K2.2.2溶液, 采用Nanodrop2000型分光光度計(jì)進(jìn)行測量。工作曲線的線性范圍在5～50 μg/mL,用該工作曲線測量14個樣本，超過50 μg/mL的樣本稀釋后測量[1](紫外分光光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與測量在北京腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科完成)。

1.3.2 半定量的TLC碘顯色法 配制標(biāo)準(zhǔn)K2.2.2溶液(100.0、50.0、25.0、10.0 μg/mL),點(diǎn)樣100 μL于TLC板, 晾干，置于層析缸內(nèi)進(jìn)行層析，展開劑為V(甲醇)∶V(氨水)=90∶10，展開到前沿95 mm至100 mm， K2.2.2的Rf值為0.3～0.4。層析后用熱空氣吹干，放置在TLC顯色缸內(nèi)用碘蒸氣顯色，目測結(jié)果，并用數(shù)碼相機(jī)攝像記錄。該法用于14個樣本測量，每個樣品點(diǎn)樣體積均為100 μL，顯色結(jié)果攝像記錄[7]。

1.3.3 LC-MS/MS法 配制標(biāo)準(zhǔn)K2.2.2溶液, 用于制備LC/MS/MS的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 測量保留時間5.1 min 處的峰面積與K2.2.2含量的線性。工作曲線的線性范圍1 000～3 000 ng/mL, 用該工作曲線測量14個樣本, 超過3 000 ng/mL的樣本稀釋后再進(jìn)行測量[5]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 分光光度計(jì)法

在253 nm下， 濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.000 980x+0.003 447,相關(guān)系數(shù)為0.997。 用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算14個樣品，結(jié)果見表1。 其中9個陰性樣品均測量到了紫外吸收，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算K2.2.2含量的范圍在6.7 μg/mL～470.0 μg/mL之間, 其中以檸檬酸緩沖液、Dowex 50淋洗液和三氟甘露糖溶液的測量值最高,IC-H柱和Al2O3柱淋出液結(jié)果也較高。2個陽性樣品結(jié)果高于實(shí)際含量, 約高出40 μg/mL。3個供試品的測量值從14.3 μg/mL到19.2 μg/mL, 其含量低于我國規(guī)定的25 μg/mL[4]。

2.2 半定量TLC 碘顯色法

采用半定量的TLC 碘顯色法，先分別測量100.0、50.0、25.0、10.0 μg/mL四個標(biāo)準(zhǔn)K2.2.2溶液，均可以明顯目視觀察到染色，且隨濃度增加，染色度增加(圖1)。

表1 14個樣品來源及三種測量方法的測量結(jié)果Table 1 The source of 14 samples and the results of the three methods for K2.2.2

注：1) 為沒有顯色斑點(diǎn)

再用相同方法測量以上14個樣品，結(jié)果示于圖2。由圖2可見，8號和9號測出了K2.2.2，其余均沒有測到斑點(diǎn)，其中8號顯色斑點(diǎn)明顯強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)板上的25.0 μg/mL，而9號斑點(diǎn)弱于標(biāo)準(zhǔn)板上的25.0 μg/m，強(qiáng)于10.0 μg/mL。 5號樣品原點(diǎn)有一斑塊,但經(jīng)展開劑展開后,該斑塊沒有移動,說明不是K2.2.2。此外，11號也有一點(diǎn)樣斑，同樣沒有移動。因此可以認(rèn)為這些沒有顯色的樣品，其K2.2.2含量低于10.0 μg/mL。

圖1 TLC 碘顯色法半定量測量K2.2.2陽性樣品結(jié)果Fig.1 Iodine-vapor TLC for semiquantitative measured K2.2.2 in positive samples

2.3 LC-MS/MS法

用LC-MS/MS繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=109x+1.93E+005, 線性相關(guān)系數(shù)為0.999。依據(jù)該曲線,分析14個樣品，結(jié)果如下：9個陰性樣品在固定保留時間5.1 min處的峰面積經(jīng)計(jì)算小于1 μg/mL;2個陽性樣品的K2.2.2分別為26.89 μg/mL和10.9 μg/mL,與實(shí)際含量相差不大；而三批供試品測量K2.2.2的含量均低于1 μg/mL。

2.4 結(jié)果比較

2.4.1 9個陰性樣品的測量結(jié)果

分光光度計(jì)法測量9個不含K2.2.2的溶液，均測量到了紫外吸收，并將之換算成K2.2.2，其中以檸檬酸鈉緩沖液和前體的乙腈溶液最高。 半定量的TLC 碘顯色法和LC-MS/MS法均沒有測量到K2.2.2。

圖2 TLC碘顯色法半定量測量14個樣品K2.2.2結(jié)果Fig.2 Iodine-vapor TLC for semiquantitative measured K2.2.2 in 14 samples

2.4.2 2個陽性樣品的測量結(jié)果

2個陽性樣品溶液(K2.2.2含量10.0 μg/mL,30.0 μg/mL)，以上三種方法均測量到了K2.2.2。分光光度計(jì)法結(jié)果偏高, 半定量的TLC 碘顯色法可半定量測出，而LC-MS/MS法的結(jié)果與實(shí)際最相近。

2.4.3 3批供試樣品的測量結(jié)果

分光光度計(jì)法測三批18F-FDG注射液的K2.2.2含量分別為14.3、15.3、19.2 μg/mL，但半定量的TLC 碘顯色法沒有顯色斑點(diǎn)，K2.2.2低于10.0 μg/mL; LC-MS/MS法經(jīng)特定保留時間內(nèi)吸收峰計(jì)算, 3批供試樣品中K2.2.2含量均低于1 μg/mL。

3 討論

紫外分光光度計(jì)測量18F-FDG中K2.2.2含量是依據(jù)K2.2.2在pH 6.4 的檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液介質(zhì)中與Pb(II)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，在波長253 nm有最大吸收，顯色后，其吸光度立即達(dá)到最大值，顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好[1]。文獻(xiàn)[7]考察了分光光度計(jì)法的準(zhǔn)確度、精密度、測量限和定量限，但未見文獻(xiàn)研究該方法的專屬性,文獻(xiàn)[3]在對比紫外分光光度計(jì)與HPLC法測量樣品中K2.2.2時發(fā)現(xiàn), 紫外分光光度法測定K2.2.2時，存在干擾，使測量結(jié)果偏高。

目前18F-FDG制備均采用以三氟甘露糖為前體與氟-18親核取代反應(yīng)，經(jīng)酸水解或堿水解后經(jīng)吸附(Dowex50)或中和pH(IC-H柱或檸檬酸鈉)后，經(jīng)純化柱(C-18柱和Al2O3柱)除雜質(zhì)，過無菌濾膜即可[6-8]。在制備過程中使用了多種試劑和純化柱，在測量K2.2.2時，一定要考慮試劑和輔料對K2.2.2測量的影響。本研究設(shè)計(jì)了強(qiáng)陽離子交換樹脂IC-H和Dowex50淋洗液、純化柱C-18柱和Al2O3柱淋出液、20%乙腈溶解的三氟甘露糖,以及檸檬酸緩沖溶液作干擾劑。結(jié)果表明：以上雜質(zhì)或輔料均影響了紫外分光光度計(jì)的結(jié)果,分光光度計(jì)測量依據(jù)樣品在253 nm下吸收,并將之全部轉(zhuǎn)化計(jì)算為K2.2.2。制備18F-FDG過程中所用的強(qiáng)離子交換樹脂 Dowex 50和IC-H柱會脫色，淋洗樹脂水液體有一定的顏色, 這些顏色在253 nm下有吸收。同時發(fā)現(xiàn), 隨IC-H淋洗體積(次數(shù))的增加(2號與3號樣品比較)而干擾減小, 說明純化柱在使用前應(yīng)用足夠的水沖洗以減少其他雜質(zhì)。 C-18柱和Al2O3柱淋洗液干擾可能是淋洗液中小顆粒物，而20%乙腈溶解的三氟甘露糖影響可能是有機(jī)溶劑或三氟甘露糖的的影響。測量體系本身為檸檬酸緩沖溶液,5號樣品中0.25 mol/L檸檬酸鈉溶液本身產(chǎn)生的紫外吸收使測量值偏高所致。以上因素對半定量TLC 碘顯色法和LC-MS/MS均沒有干擾, 半定量TLC 碘顯色法和LC-MS/MS采用了適當(dāng)?shù)姆蛛x方法, 將干擾劑分開，如TLC發(fā)現(xiàn)5號和11號樣品在原點(diǎn)有顯色，由于K2.2.2的遷移，可以排除干擾。

本研究采取了供試樣與測量由兩個單位完成，因此造成了陽性樣品紫外分光光度計(jì)測量結(jié)果偏差較大，總體結(jié)果偏高，可能與標(biāo)準(zhǔn)品的來源和批號等因素有關(guān)。

分光光度計(jì)測量三批供試品(18F-FDG注射液)中K2.2.2含量均在25 μg/mL以下(14.3、15.3、19.2 μg/mL), 該結(jié)果同中國藥品食品檢定研究院測量本院其他三批18F-FDG一致(13、11、16 μg/mL)。半定量TLC 碘顯色法和LC-MS/MS測量三批供試品的結(jié)果低于分光光度計(jì), 文獻(xiàn)[3]也發(fā)現(xiàn)了HPLC法測量K2.2.2的結(jié)果低于分光光度計(jì)，供試品中存在的干擾物質(zhì)造成了分光光度計(jì)測量結(jié)果偏高。從陰性樣品、陽性樣品和供試品的測量結(jié)果說明，紫外分光光度計(jì)測量K2.2.2方法專屬性差。我國藥典2014年12月4日再次公示的18F-FDG國家標(biāo)準(zhǔn)草案中，將K2.2.2測量方法由紫外分光光度計(jì)法改成了氯鉑酸/碘化鉀顯色法[9]。

碘蒸氣顯色法采用層析分離后的有機(jī)化合物吸附碘蒸氣較多，引起有機(jī)化合物斑點(diǎn)顏色較濃，而TLC 背景顏色為淡黃色，通過對比標(biāo)準(zhǔn)液的顯色斑點(diǎn)顏色即半定量測量樣品K2.2.2含量。方法簡單, 特異性高、結(jié)果可靠。前期研究發(fā)現(xiàn)如果點(diǎn)樣體積小，會出現(xiàn)假陰性，為了保證結(jié)果的可重復(fù)性，點(diǎn)樣體積最好固定在100 μL，同時從染色缸內(nèi)取出TLC板后立即照相，以防止碘揮發(fā)而退色。從本研究的對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 半定量TLC 碘顯色法專屬性較好,結(jié)果可靠但點(diǎn)樣體積偏大。雖然我國新的18F-FDG標(biāo)準(zhǔn)中K2.2.2殘留測量為氯鉑酸/碘化鉀顯色法，但文獻(xiàn)認(rèn)為氯鉑酸/碘化鉀顯色法特異性差，可能存在假陽性。如果氯鉑酸/碘化鉀顯色法測量結(jié)果存異義時，建議采用碘蒸氣顯色法復(fù)核[10]。

4 結(jié)論

紫外分光光度計(jì)法測量18F-FDG中的K2.2.2含量的專屬性差，干擾因素多，結(jié)果不可靠，不適于常規(guī)18F-FDG的質(zhì)量控制；半定量TLC 碘顯色法專屬性強(qiáng)，方法簡單，結(jié)果可靠，可考慮用于常規(guī)18F-FDG的質(zhì)量控制。

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Specificity of the Spectrophotometry for Detecting Aminopolyether K2.2.2in18F-FDG

ZHANG Jin-ming1, CHEN Zheng-yu2, WU Xiang-feng3, ZHANG Xiao-jun1, ZHU Hua4, ZHOU Ming1, YANG Zhi4

(1.DeptofNuclMed,ThePLAGeneralHopspital,Beijing100853,China；2.DrugandMedicalEquipmentAdministrationBureauofHealthDepartment,Beijing100842,China；3.DrugandMedicalEquipmentInspectionInstritueofHealthDepartment,Beijing100071,China；4.DeptofNuclMed,PekingUniversityCancerHospital,Beijing100036,China)

The residue of K2.2.2was one of the key metric in18F-FDG quality control. The specificity of the spectrophotometry for K2.2.2was compared with others. Methods: The 14 samples were determined for the K2.2.2by the spectrophotometry and iodine-vapor TLC stain method, respectively. The results were compared with LC-MS/MS. The spectrophotometry showed that the 9 of negative samples were false positive , 2 of positive samples were higher than its actual K2.2.2contents, 3 of18F-FDG injections contained 14.3-19.2 μg/mL for K2.2.2. The iodine-vapor TLC stain method showed that 9 of negative samples were negative, 2 of positive samples were the same with its K2.2.2contents, 3 of18F-FDG injections were lower than 10 μg/mL with K2.2.2. The iodine-vapor TLC stain results were confirmed by the LC-MS/MS. Results: The specificity of spectrophotometry was poor for K2.2.2. The iodine-vapor TLC stain was simple and good specificity method for K2.2.2in18F-FDG injections.

spectrophotometry; aminopolyether; TLC; LC-MS/MS; specificity

10.7538/tws.2015.28.03.0129

2015-01-20;

2015-04-01

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高項(xiàng)目(14ZJZ21-1)

張錦明(1965—)，男，博士，主要研究新型正電子放射性藥物的合成和應(yīng)用

TL92+3

A

1000-7512(2015)03-0129-06