李超然，孫忠人，仇立波，孫琦

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

壓瘡又稱為褥瘡、席瘡、壓力性潰瘍，多由于皮膚組織長期受到壓力、剪切力、摩擦力作用，使組織持續(xù)缺血、缺氧、營養(yǎng)不良而致骨突隆處局限性損傷?，F(xiàn)代研究表明，通過電刺激可以治療皮膚損傷類疾?。?］。由此推斷電針療法對壓瘡局部皮膚修復(fù)具有促進(jìn)作用。電針具有運行氣血、通絡(luò)活絡(luò)、祛瘀止痛之功效，在創(chuàng)面修復(fù)過程中起到良好的抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖再生、提高機體免疫力的作用，但其具體作用機制尚未明確?，F(xiàn)代實驗及臨床研究證實，促血管生成(Angiopoitins)家族中Ang-1與Ang-2兩種生長因子對形成生理狀態(tài)下血管至關(guān)重要。因此本實驗通過連續(xù)觀察電針傍刺對大鼠皮膚壓瘡修復(fù)過程中創(chuàng)面修復(fù)的形態(tài)學(xué)變化以及對血管生成素Ang-1與Ang-2表達(dá)的影響，探究電針傍刺對大鼠壓瘡皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的作用。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

健康清潔級SD大鼠90只，雌性，體質(zhì)量250g～300g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。動物合格證號為SCXK京2009-001。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境，室溫20～28℃，相對濕度40%～50%，自然照明，單籠飼養(yǎng)。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為電針組、針刺組、空白組，每組30只。每組30只大鼠再隨機分為5個治療時間點，即1天組、3天組、5天組、7天組、9天組，每組6只。實驗動物的使用與操作方法嚴(yán)格遵循國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 試劑及儀器

免疫組化試劑Rabbit Angiopoietion 1 Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-Angiopoietin 2(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司);戊巴比妥麻醉劑(德國Merck公司);華佗牌0.25mm×13mm針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);薇婷脫毛膏(中國利潔時家化有限公司);碘伏(山東利爾康消毒科技股份有限公司);酒精(齊齊哈爾市藥研消毒劑廠)。

1.3 儀器

體質(zhì)量秤(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);G6805-B電刺激儀(上海欣曼科教設(shè)備有限公司);CX41奧林巴斯顯微鏡(日本奧林巴斯公司);TKC9201EC型JVC攝像頭(日本JVC公司);RM2235型LEICA切片機(德國LEICA公司)。

2 方法

2.1 大鼠皮膚壓瘡模型制備

將清潔級實驗SD大鼠90只，在標(biāo)準(zhǔn)實驗條件下喂養(yǎng)，每天給予標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)，自由攝食飲水，實驗全程單籠飼養(yǎng)。

自制裝置:切取3塊長方體有機玻璃板，并在一塊有機玻璃板中心鉆一圓孔，將其用亞克力膠水粘成n形。再將膨脹螺絲外管穿過中心圓孔，其上放置礦泉水瓶底座，其內(nèi)放入鐵砂。外周配合尼龍扎帶以固定壓瘡位置［2］。

將大鼠常規(guī)捆綁固定后脫毛處理，并將其用尼龍扎帶固定于鐵絲網(wǎng)上。其后將裝置固定于大鼠腿部近膝關(guān)節(jié)骨隆突處，并將自制裝置、大鼠、鐵絲網(wǎng)共同置于水平實驗臺上，使壓力基本呈垂直狀態(tài)作用于大鼠近膝關(guān)節(jié)骨隆突處。

先用碘伏對裝置接觸處及大鼠腿部造模位置消毒，后以75%酒精脫碘。采用缺血-再灌注損傷方式建立壓瘡創(chuàng)面。壓強P=100mmHg，以螺釘錐度的面積作為壓瘡模型面積S=1cm2，計算出所需鐵砂的質(zhì)量M=134g［3］。

將自制裝置持續(xù)作用于大鼠造模位置2h，使局部組織處于缺血狀態(tài)，再將大鼠松開活動，自由攝食進(jìn)水0.5h，此記為一個循環(huán)。故每個循環(huán)為2h缺血期和0.5h再灌注期，每日5個循環(huán)，連續(xù)造模3天?？傆嬋毖?再灌注15個損傷循環(huán)，缺血時間30h［3］。

2.2 治療方法

造模成功1天后進(jìn)行治療。將大鼠按模型制備的方法常規(guī)固定，裸露腿部壓瘡損傷處。針刺組采用傍刺方法，在創(chuàng)面中間垂直針刺1針，然后在創(chuàng)面外周平刺第2針，方向與中心針尖相對，兩針深度均為0.2寸左右。連接6805-B電針儀，但不通電。電針組先同針刺組傍刺治療，后連接電針儀通電。負(fù)極連接壓瘡皮膚中心直刺第1針，正極連接創(chuàng)面外周平刺第2針，電流強度0.5mA，頻率0.5Hz，疏密波?？瞻捉M不針刺，僅將大鼠固定于鐵絲網(wǎng)上靜置未給予任何治療措施。3組大鼠每次治療30min，每日1次。同時給予相同基礎(chǔ)飼養(yǎng)方式。

2.3 樣本采集

造模3天結(jié)束后，將電針組、針刺組與空白組90只大鼠按1天、3天、5天、7天、9天進(jìn)行治療，并在第2天、4天、6天、8天、10天取壓瘡損傷處皮膚組織標(biāo)本。稱大鼠重量，給予1%戊巴比妥350mg/1000g腹腔麻醉注射。麻醉后，在皮損部位切取正方形(1cm2)全層皮膚組織。用10%甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，切片。經(jīng)恒溫箱烤片后，再將切片脫蠟、染色、脫水、透明、封片，進(jìn)行免疫組化學(xué)觀察。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 壓瘡分期診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照2007年美國壓瘡專家委員會(NPUAP)壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)，將壓瘡損傷標(biāo)準(zhǔn)定為II期及以上［4］。

Ⅰ期:在骨隆突處的皮膚完整伴有壓之不褪色的局限性紅斑。深色皮膚可能無明顯的蒼白改變，但其顏色可能與周圍組織不同。Ⅱ期:真皮層部分缺失，表現(xiàn)為一個淺的開放性潰瘍，無壞死組織或青腫。伴粉紅色傷口床(創(chuàng)面)，無腐肉，也可能表現(xiàn)為一個完整的或破裂的血清性水皰。Ⅲ期:全層皮膚組織缺失，可見皮下脂肪暴露，骨頭、肌腱、肌肉未外露;有腐肉存在，但組織缺失的深度不明確，可能包含有潛行和隧道。Ⅳ期:全層組織缺失，伴有骨、肌腱或肌肉外露。傷口床的某些部位有腐肉或焦痂，常有潛行或隧道。

2.4.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

觀察造模期間大鼠傷口情況，具體包括滲出物(血性、膿性、水性、無);結(jié)痂次數(shù)、部位(中心、周圍)、質(zhì)地(較軟、較硬)及顏色(紫紅、鮮紅、灰白、黃褐、黃白、黑色)等。

2.4.3 大鼠行為學(xué)觀察

觀察造模期間大鼠精神狀態(tài)，具體包括整體狀況(活躍、良好、安靜)、性情(暴躁、溫順、低迷)、步態(tài)(正常、活動不利、跛行、拖行)、二便情況(正常、便稀、便干)等。

2.4.4 免疫組化檢查及結(jié)果判斷

Ang-1及Ang-2表達(dá)測定:取石蠟組織4μm切片，進(jìn)行常規(guī)免疫組化處理。采集每張切片在400×倍光鏡下的5個視野圖像。光鏡下將Ang-1及Ang-2陽性定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和(或)包膜，呈細(xì)小棕黃色顆粒彌漫分布［5］。根據(jù)觀察可見，免疫組化染色深度著色明顯且基本一致，表達(dá)細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒較細(xì)，故將陽性細(xì)胞積分均記為1分。為更鮮明表述陽性細(xì)胞及其分布區(qū)域，免疫組化染色圖示均以200×光鏡下采集的視野作為示例。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行分析，計量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間組內(nèi)計量資料比較均采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有顯著性意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 傷口修復(fù)的形態(tài)學(xué)變化

治療第1天，大鼠精神狀態(tài)良好，性情暴躁。大部分壓瘡皮膚出現(xiàn)膿性或血性滲出物，質(zhì)地軟，且有波動性，大鼠呈跛行步態(tài);治療第2天，電針組大部分創(chuàng)面干燥，逐漸結(jié)痂，質(zhì)地較軟，呈紫紅色，針刺組與空白組創(chuàng)面濕潤，仍有滲出物;治療第3天，電針組結(jié)痂處皮膚由軟變硬，創(chuàng)面邊緣皮膚紅潤，呈紫紅、灰白、黃白或黃褐色，無感染，大鼠步態(tài)呈活動不利，較針刺組與空白組靈活。三組結(jié)痂處皮膚均無滲出物;治療第5天，大鼠性情溫順，壓瘡局部皮膚損傷區(qū)域縮小，結(jié)痂處可見皮膚皺褶增多，電針組可見薄皮覆蓋;治療第7天，三組大鼠步態(tài)基本恢復(fù)正常，結(jié)痂處皮膚呈黃褐色或黑色，電針組大部分創(chuàng)面基本愈合，可見結(jié)痂皮膚脫落，出現(xiàn)暗紅色肉芽組織，而針刺組于第8天結(jié)痂皮膚脫落;治療第9天，電針組與針刺組創(chuàng)面基本愈合，僅遺留不明顯線性痕跡，空白組仍存在少部分未愈合創(chuàng)面。整個治療過程中大鼠二便基本正常，針刺組與空白組共2只大鼠因體質(zhì)虛弱，飼養(yǎng)環(huán)境溫度略低而至壓瘡后感染死亡。

3.2 免疫組化結(jié)果

光鏡下觀察不同時間點大鼠皮膚創(chuàng)面內(nèi)Ang-1表達(dá)情況(見圖1):在1天組中，Ang-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，其中電針組較針刺組及空白組Ang-1表達(dá)更多，陽性細(xì)胞累計積分比較無明顯差異(P＞0.05)。在3天組中，Ang-1表達(dá)均逐漸升高，且電針組與空白組Ang-1在此時間點同時達(dá)到高峰，陽性細(xì)胞數(shù)目:電針組＞針刺組＞空白組。其中電針組分別對比針刺組、空白組的陽性細(xì)胞累計積分比較差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。對比電針1天組，電針3天組的Ang-1表達(dá)顯著升高，并達(dá)到高峰(P＜0.05)。在5天組中，針刺組Ang-1表達(dá)達(dá)到峰值，對比針刺組3天明顯增高(P＜0.05)。同時，電針組與空白組Ang-1表達(dá)情況正逐漸下降，針刺組陽性細(xì)胞數(shù)目依次高于電針組、空白組，陽性細(xì)胞累計積分比較無明顯差異(P＞0.05)。在7天組中，Ang-1表達(dá)情況整體呈下降趨勢，陽性細(xì)胞數(shù)目電針組＞針刺組＞空白組，陽性細(xì)胞累計積分比較無明顯差異(P＞0.05)。在9天組中，Ang-1表達(dá)逐漸減弱且三組均呈平穩(wěn)下降狀態(tài)，陽性細(xì)胞數(shù)目電針組＞針刺組＞空白組，且電針組分別對比針刺組與空白組陽性細(xì)胞累計積分比較具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 各時間點三組間大鼠壓瘡皮膚修復(fù)組織內(nèi)Ang-1表達(dá)比較

圖2 各時間點三組間大鼠壓瘡皮膚修復(fù)組織內(nèi)Ang-2表達(dá)比較

光鏡下觀察不同時間點大鼠皮膚創(chuàng)面內(nèi)Ang-2表達(dá)情況(見圖2):在1天組中，三組Ang-2均有相應(yīng)表達(dá)，其中電針組陽性細(xì)胞數(shù)目最多，并依次大于針刺組、空白組。電針組對比空白組陽性細(xì)胞累計積分比較具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在3天組中，Ang-2表達(dá)整體呈增高趨勢，電針組Ang-1表達(dá)達(dá)到頂峰，其對比電針1天組與電針5天組均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時在此時間點，針刺組與空白組Ang-1表達(dá)均緩慢上升，故電針組對比針刺組與空白組陽性細(xì)胞累計積分比較具有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。針刺組對比空白組具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在5天組中，針刺組與空白組Ang-2表達(dá)均達(dá)到高峰，而電針組逐漸減低，且針刺組陽性細(xì)胞數(shù)目依次高于電針組、空白組。其中電針組對比針刺組、針刺組對比空白組陽性細(xì)胞累計積分比較均具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在7天組中，三組Ang-2表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢，其中針刺7天組陽性細(xì)胞數(shù)目對比針刺5天組顯著減少(P＜0.05)。因此，此時間點陽性細(xì)胞數(shù)目:電針組＞針刺組＞空白組，電針組對比針刺組、空白組陽性細(xì)胞累計積分比較均具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在9天組中，電針組Ang-2表達(dá)下降快于針刺組與空白組，故針刺組陽性細(xì)胞數(shù)目依次高于電針組、空白組。電針組對比空白組陽性細(xì)胞累計積分比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

4 討論

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，壓瘡的治療可歸屬為皮膚創(chuàng)傷性修復(fù)的范疇［8］，其是一個由多種細(xì)胞及生長因子調(diào)控的復(fù)雜分子生物學(xué)過程。在這一過程中，促血管生成素作為血管形成的信號傳導(dǎo)通路，對壓瘡后皮膚創(chuàng)面修復(fù)起到了一定的促進(jìn)作用。促血管生成素包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4。Ang-1與Ang-2是特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，其在促進(jìn)血管發(fā)生、重塑、成熟、維持、調(diào)節(jié)血管功能等方面具有重要作用，而Ang-3、Ang-4在血管新生中作用較弱［6-7］。現(xiàn)代研究表明，Ang-1的主要作用是加速形成新生血管管腔，維持血管網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性、成熟性、完整性以及靜息狀態(tài)［9］。而Ang-2作為Ang-1的拮抗劑，將破壞血管網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定平衡狀態(tài)，這將有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂及血管網(wǎng)絡(luò)的重建［5，10］。由此可見Ang-1與Ang-2通過促進(jìn)血管新生進(jìn)而加速創(chuàng)面組織的修復(fù)。國內(nèi)外研究表明，電刺激治療皮膚潰瘍頗有療效［1］，故電針療法在大鼠壓瘡皮膚組織修復(fù)方面具有一定意義。同時電針配合傍刺法可以在損傷的局部組織皮膚處形成較強的損傷電流，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移與聚集。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，電針組、針刺組和空白組Ang-1及Ang-2陽性細(xì)胞數(shù)目變化曲線均為先逐漸增高后逐漸減低，并在不同時間段出現(xiàn)峰值。由表1可知，電針組在治療3天時，陽性細(xì)胞數(shù)目依次高于空白組、針刺組，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。電針組雖與空白組增長趨勢相似，但電針組Ang-1表達(dá)情況明顯高于空白組。同時，電針3天組對比電針1天組具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，更在一定意義上證明電針傍刺極大的促進(jìn)了Ang-1的釋放。針刺組在治療5天后，Ang-1表達(dá)從3天時三組最低水平迅速增高，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而電針組與空白組Ang-1表達(dá)正逐漸下降，故陽性細(xì)胞數(shù)目針刺組＞電針組＞空白組。同時對比空白3天組Ang-1表達(dá)明顯增高，表明經(jīng)過針刺治療促進(jìn)了Ang-1的釋放，卻延后了創(chuàng)面修復(fù)組織的最佳時間，無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而由表2可知在電針組治療1天時，Ang-2在三組內(nèi)均有相應(yīng)表達(dá)，且電針組表達(dá)情況明顯高于針刺組與空白組，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在治療3天時，Ang-2在三組中表達(dá)均升高，其中電針組對比針刺組與空白組的表達(dá)明顯增高，具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時，電針1天組與電針3天組，電針3天組與電針5天組對比，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，由此可見電針傍刺極大的促進(jìn)與提前了Ang-2的釋放。在治療5天時，針刺組與空白組Ang-2表達(dá)明顯升高，而電針組表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，陽性細(xì)胞數(shù)目為針刺組＞電針組＞空白組，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明針刺治療一定意義上促進(jìn)了Ang-2的釋放。在治療7天時，三組Ang-2表達(dá)均降低，針刺組下降趨勢快于電針組與空白組，故針刺5天組對比針刺7天組具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。陽性細(xì)胞數(shù)目依次為電針組、針刺組、空白組，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明三種治療方法后Ang-2的釋放均逐漸下降。治療9天時，電針組出現(xiàn)顯著下降，對比空白組具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。故電針傍刺促進(jìn)了大鼠壓瘡皮膚組織內(nèi)Ang-1及Ang-2的表達(dá)，同時提前了Ang-2的釋放，從而加快了創(chuàng)口愈合的速度，使創(chuàng)面皮膚修復(fù)時間縮短。

綜上所述，電針傍刺治療皮膚壓瘡安全、簡單、無副作用。其可以通過促進(jìn)促血管生成素Ang-1及Ang-2的表達(dá)，加速Ang-2的釋放，使創(chuàng)面的血管內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖與再生，從而加快皮膚壓瘡后創(chuàng)面的修復(fù)，縮短創(chuàng)傷愈合時間。本實驗為動物研究，其雖為臨床研究提供了基礎(chǔ)及理論依據(jù)，但更深層次的臨床分子生物學(xué)作用機制以及臨床研究尚需進(jìn)一步探討。

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