王一波, 湯黎明

(1. 南京醫(yī)科大學附屬常州市第二人民院 普外科, 江蘇 常州, 213000;

2. 江蘇大學附屬武進醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213002)

MMP-2、MMP-7和MMP-14在胃癌患者組織中表達的臨床意義

王一波1,2, 湯黎明1

(1. 南京醫(yī)科大學附屬常州市第二人民院 普外科, 江蘇 常州, 213000;

2. 江蘇大學附屬武進醫(yī)院 普外科, 江蘇 常州, 213002)

摘要:目的探討胃癌組織中MMP-2、MMP-7和MMP-14的表達及臨床意義。方法應用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色法(S-P)法檢測98例胃癌組織中MMP-2、MMP-7和MMP-14蛋白的表達。對照組20例為良性胃病變黏膜組織。結(jié)果胃癌組中MMP-2、MMP-7和MMP-14表達的陽性率明顯高于對照組(P<0.05); 胃癌組中MMP-2及MMP-14的陽性表達率與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、大體分型、臨床腫瘤分期有關(P<0.05或P<0.01)。MMP-7的陽性表達率與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、分化程度、大體分型、臨床腫瘤分期有關(P<0.05或P<0.01)。MMP-2和MMP-7蛋白表達正相關性(r=0.271,P<0.01); MMP-2和MMP-14蛋白表達正相關性(r=0.268,P=<0.01); MMP-7和MMP-14蛋白表達正相關性(r=0.202,P<0.05)。結(jié)論MMP-2、MMP-7、MMP-14的表達上調(diào)與胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移有關。

關鍵詞:胃癌; 基質(zhì)金屬蛋白酶-2; 基質(zhì)金屬蛋白酶-7; 基質(zhì)金屬蛋白酶-14

在中國, 胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一，其死亡率居高不下，多數(shù)患者就診時已屬漿膜侵犯的進展期。胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移在本質(zhì)上是一個由多步驟、多環(huán)節(jié)構(gòu)成的復雜事件。研究表明,癌細胞可產(chǎn)生大量溶解酶降解基質(zhì)或基底膜，這些溶解酶與癌侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著相關,溶解酶系統(tǒng)由一龐大的蛋白溶解酶家族構(gòu)成,被稱為基質(zhì)金屬蛋白酶。本文采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色法(S-P)法檢測98例胃癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)和基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP-14)蛋白的表達，探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1材料與方法

1.1　一般資料

經(jīng)本院倫理學會批準，選擇臨床及病理資料完整的江蘇大學附屬武進醫(yī)院普外科2008年1月—2009年12月手術切除并經(jīng)病理證實為胃癌患者98例。所有患者術前均未進行化療、放療或生物治療,術前及術后病理學檢查均診斷為胃癌。其中男60例，女38例；年齡23～82歲，年齡≥60歲46例，<60歲52例，平均(61.3±12.5)歲；腫瘤的原發(fā)灶大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均由病理觀察確定，遠處轉(zhuǎn)移由病理學和臨床聯(lián)合確定。根據(jù)1990年世界衛(wèi)生組織(WHO)腫瘤分化程度判斷標準將胃癌患者分為高、中、低分化組,其中高分化組8例，中分化組50例，低分化組40例。胃癌分期采用2002年國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標準,其中Ⅰ/Ⅱ期患者36例, Ⅲ/Ⅳ期患者62例。Borrmann分型為Ⅰ/Ⅱ型者54例, Ⅲ/Ⅳ型者44例。腫瘤直徑≥5 cm者33例，<5 cm者65例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者71例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者巧27例。腫瘤浸潤深度局限在漿膜層及漿膜內(nèi)者66例,累及漿膜層外者32例。腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移者28例,無轉(zhuǎn)移者70例。胃癌免疫組織化學法對照組例數(shù)為20例，為良性胃病變黏膜組織。

1.2　實驗方法

① 制片。將蠟塊制成4 μm厚的切片，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，于60 ℃的烤箱內(nèi)烤片72 h以上; ② 染色。常規(guī)HE染色，確定標本的組織分化程度。具體操作步驟如下：二甲苯I、II浸泡各15 min脫蠟；100%酒精浸泡5 min; 95%、85%、75%梯度酒精沖洗水化；蘇木素染色6 min; 鹽酸酒精分化2～3 s; 溫水浸泡返藍10 min; 伊紅染色6 min; 75%、85%、95%梯度酒精沖洗；100%酒精Ⅰ、Ⅱ浸泡各5 min; 二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡各5 min; 中性樹膠封片。以上操作均在室溫下進行，進行前用水充分沖洗; ③ 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色法(S-P法)。具體操作步驟如下: ① 烤片, 68 ℃, 20 min; ② 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯Ⅰ 20 min -二甲苯Ⅱ 20 min-100%酒精Ⅰ10 min -100%Ⅱ 10 min -95% 5 min-80% 5 min-70% 5 min; ③ 阻斷。滅活內(nèi)源性過氧化物酶: 3% H2O237 ℃孵育10 min，PBS沖洗3×5 min; ④ 抗原修復:置0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中用煮沸(95 ℃, 15～20 min)，自然冷卻20 min 以上，再用冷水沖，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min; ⑤ 正常羊血清工作液封閉, 37 ℃10 min, 傾去勿洗; ⑥ 滴加一抗4 ℃冰箱孵育過夜, PBS沖洗3×5 min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)；滴加生物素標記二抗, 37 ℃孵育30 min, PBS沖洗3×5 min; ⑦ 滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液, 37 ℃孵育30 min, PBS沖洗3×5 min; ⑧ DAB/H2O2反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片; ⑨ 對照：用已知陽性的切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照; ⑩ 工作濃度: MMP-2一抗工作濃度為1∶40, MMP-7一抗工作濃度為1︰25，MMP-14一抗工作濃度為1∶100。

1.3　結(jié)果判定

均以細胞漿內(nèi)或細胞膜上出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性著色。每例隨機觀察5個高倍視野,結(jié)果采用半定量積分法，首先將染色強度打分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色 (染色深淺需與背景著色相對比)。再將陽性細胞所占的百分比打分: 0分為陰性, 1分為陽性細胞簇10%, 2分為11%～50%, 3分為51%～75%, 4分為>75%。染色強度與陽性細胞百分比的乘積≥3分為陽性,<3分為陰性，以上評分由兩位不知具體臨床資料的病理專家單獨進行評分。用PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.4　統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理, MMP-2,MMP-7及MMP-14表達強度在不同病理分級和TNM分期的比較采用單因素方差分析，采用χ2檢驗或者運用Fisher精確概率法進行統(tǒng)計；組間相關性采用Pearson相關分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1　MMP-2、MMP-7和MMP-14在2組中表達陽性率的比較

MMP-2在胃癌組織中的陽性表達率為77.6%(76/98)，明顯高于在非腫瘤胃黏膜組織中的10%(2/20); MMP-7在胃癌組織中的陽性表達率為69.4%(68/98)，明顯高于在非腫瘤胃黏膜組織中的0%(0/20); MMP-14在胃癌組織中的陽性表達率為76.5%(75/98)，明顯高于在非腫瘤胃黏膜組織中的5%(1/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1及表1。

表1　MMP-2、MMP-7 和MMP-14在2組中

與對照組比較，**P<0.01。

A.MMP-2;B.MMP-7;C.MMP-14圖1 MMP-2、MMP-7、MMP-14在胃癌組織中陽性表達 (SP法 200倍)

2.2　胃癌組織中MMP-2、MMP-7蛋白和MMP-14蛋白的表達與胃癌臨床病理特征的關系

胃癌患者中MMP-2陽性率為77.6%, MMP-14為76.5%, 二者在胃癌組織中的陽性表達率與患者的性別、年齡、分化程度無相關性(P>0.05), 而二者的陽性表達率與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、大體分型、臨床腫瘤分期有關(P<0.05或P<0.01)。MMP-7表達陽性，陽性率為69.4%, 在胃癌組織中的陽性表達率與患者的性別、年齡、腫瘤大小無相關性(P>0.05), 而MMP-7的陽性表達率與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、分化程度、大體分型、臨床腫瘤分期有關(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.3　胃癌組中MMP-2、MMP-7和MMP-14表達的相關性分析

98例胃癌組織中三種蛋白的相關性分析結(jié)果顯示，MMP-2和MMP-7蛋白表達正相關性(r=0.271,P<0.01); MMP-2和MMP-14蛋白表達正相關性(r=0.268,P<0.01); MMP-7和MMP-14蛋白表達正相關性(r=0.202,P<0.05)。

3討論

基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)是一種重要的蛋白水解酶家族，研究[1]表明其參與了多種腫瘤如肺癌、胰腺癌、肝癌等浸潤與轉(zhuǎn)移，機制是降解細胞外基質(zhì)，同時具有促進新生血管生成、調(diào)節(jié)細胞間黏附、信號傳導等來促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,目前已知多種MMPs與胃癌密切相關。本文所研究的MMP-2、MMP-7、MMP-14是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員, MMP-2屬于胞質(zhì)型基質(zhì)金屬蛋白酶，又稱Ⅳ型膠原酶(膠原酶A)，其作用底物主要是Ⅳ型膠原和明膠; MMP-7屬于基質(zhì)溶解素類，通過降解彈性蛋白、層黏蛋白、Ⅳ型膠原等細胞外基質(zhì)和基底膜成分；它可以活化MMP-2和MMP-9。MMP-14屬于膜型基質(zhì)金屬蛋白酶，可直接降解Ⅰ、Ⅱ型以及明膠等膠原蛋白，還可以激活多種基質(zhì)金屬蛋白酶包括MMP-2和MMP-13[2-3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組MMP-2蛋白主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜，對照組絕大多數(shù)未見表達，極少數(shù)呈散在性弱表達。98例男性胃癌患者中76例MMP-2表達陽性(77.6%), 在胃癌組織中的陽性表達率與患者的性別、年齡、分化程度無相關性(P>0.05), 而MMP-2的陽性表達率與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、大體分型、臨床腫瘤分期有關(P<0.05或P<0.01)。Zheng等[4]發(fā)現(xiàn)，在胃癌中,MMP-2的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴管和血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的程度呈明顯的正相關。本研究結(jié)果也證實了MMP-2與胃癌的浸潤深度、淋巴管浸潤、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關,并通過對2組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的差異比較,進一步證明了MMP-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的重要促進作用。也有研究[5]表明，MMP-2的表達和腫瘤細胞的組織學分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關。MMP-7蛋白主要表達于胃癌細胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色，多呈散在的片狀或灶性分布，而且在腫瘤細胞周圍的纖維細胞也可見到棕染顆粒。98例男性胃癌患者中68例MMP-7表達陽性, MMP-7的陽性率為69.4%, 在胃癌組織中的陽性表達率與患者的性別、年齡、腫瘤大小無相關性(P>0.05), 而MMP-7的陽性表達率與胃癌的腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、分化程度、大體分型、臨床腫瘤分期有關(P<0.05或P<0.01)。上述研究[6]表明，MMP-7蛋白參與胃癌的進展過程，導致胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，這與有關的研究結(jié)果相似。胃癌組MMP-14為細胞質(zhì)內(nèi)表達，鏡下觀察腫瘤細胞胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色細小顆粒狀，染色明顯高于背景為陽性。對照組絕大多數(shù)未見表達，極少數(shù)呈散在性弱表達。98例男性胃癌患者中，75例MMP-14表達陽性，MMP-14的陽性率為76.5%，在胃癌組織中的陽性表達率與患者的性別、年齡、分化程度無相關性(P>0.05)，而MMP-14的陽性表達率與胃癌的腫瘤浸潤深度、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、大體分型、臨床腫瘤分期有關(P<0.05或P<0.01)。

表2　胃癌組MMP-2、MMP-7和MMP-14 的陽性表達在不同臨床病理特征中的關系[n(%)]

Yoshikawa等[7]研究證實了在多種腫瘤組織中均有MMP-14蛋白及其mRNA的過度表達，如在肺癌、胃癌、胰腺癌等腫瘤組織中均高表達，且與MMP-2的表達呈正相關，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移。Shim等[8]研究發(fā)現(xiàn),胃癌與正常胃組織中的MMP-14mRNA的比值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關。

膜型基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-14主要位于腫瘤細胞膜上,能激活前MMP-2,使之轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?同時能直接降解細胞外基質(zhì),導致腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，而MMP-2的作用底物是Ⅳ型膠原,它能直接分解基底膜中的纖維連接蛋白和層粘連蛋白,在腫瘤細胞突破基底膜屏障引起浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用，這提示MMP-2、MMP-14參與了胃癌的直接浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9], 本實驗也顯示MMP-2、MMP-14在胃癌組織中的表達呈正相關,這可能與MMP-14能活化MMP-2有關。其機制可能是MMP-2通過促進MMP-14的表達上調(diào)，從而加速降解細胞外基質(zhì)從而促進胃癌的浸潤與轉(zhuǎn)移，促進腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[10]。MMP-7和MMP-14蛋白表達正相關性，表明這兩種蛋白在降解細胞外基質(zhì)方面著一定的協(xié)同作用[11-13]。以上結(jié)果均提示MMP-2、MMP-7、MMP-14基因與胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的生物學行為相關,能反映胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移潛能，可作為新的腫瘤生物學標志物,為胃癌患者的預后判斷提供幫助[14-16]。

綜上所述, MMP-2、MMP-7及MMP-14可以促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。三者高表達均與胃癌的浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴管浸潤及較高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率有關，可作為胃癌惡性程度的預測因子[17-19]。利用免疫組化檢測胃癌中MMP-2、MMP-7、MMP-14的表達來判斷腫瘤的惡性程度及預后,指導手術及術后綜合治療,具有一定的臨床意義[20-21]。

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Expression and clinical significance of

MMP-2, MMP-7 and MMP-14 in the tissue

of patients with gastric cancer

WANG Yibo1,2, TANG Liming1

(1.DeprtmentofGeneralSurgery,ChangzhouSecondPeople′sHospitalAffiliatedto

NanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213002; 2.DeprtmentofGeneral

Surgery,WujinHospitalAffiliatedtoJiangsuUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213002)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 in the tissue of patients with gastric cancer. MethodsThe expressions of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 were detected by S-P immunohistochemical staining in gastric cancer (n=98) and normal control(n=20). ResultsIn gastric cancer group, the positive expression rate of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 were significantly higher than those in normal control group(P<0.05). The positive expression rate of MMP-2 and MMP-14 in gastric cancer were correlated with the depth of invasion, lymph node metastasis, tumor size, macroscopic type, tumor clinical stage (P<0.05,P<0.01). The positive expression rate of MMP-7 in the gastric cancer was correlated with the depth of invasion, lymph node metastasis, differentiation, macroscopic type, tumor clinical stage (P<0.05,P<0.01). The correlation analysis showed that there was positive correlation between expressions of MMP-2 and MMP-7 (r=0.271,P<0.01). There was positive correlation between expression of MMP-2 and MMP-14 (r=0.268,P<0.01). There was positive correlation between expression of MMP-7 and MMP-14 (r=0.202,P<0.05). ConclusionUp-regulation of MMP-2, MMP-7 and MMP-14 were correlated with invasion and metastasis of gastric cancer.

KEYWORDS:gastric cancer; matrix metalloproteinase-2; matrix metalloproteinase-7; matrix metalloproteinase-14

通信作者:湯黎明, E-mail: Drtanglm@gmail.com

基金項目:江蘇省衛(wèi)生廳面上項目(D2010023)

收稿日期:2015-03-10

中圖分類號:R 735.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)15-044-05

DOI:10.7619/jcmp.201515013