董　力, 王　建, 賈晨虹, 郭琳娜

(1. 河北省廊坊市人民醫(yī)院 藥學(xué)部, 河北 廊坊, 065000;

2. 中國(guó)石油天然氣總公司中心醫(yī)院 藥劑科, 河北 廊坊, 065000;

3. 河北省廊坊市中醫(yī)醫(yī)院 藥房, 河北 廊坊, 065000;

4. 河北省廊坊市人民醫(yī)院 特需病房,河北 廊坊, 065000)

論著

雙環(huán)醇治療大鼠慢性酒精性肝病的機(jī)制探討

董力1, 王建2, 賈晨虹3, 郭琳娜4

(1. 河北省廊坊市人民醫(yī)院 藥學(xué)部, 河北 廊坊, 065000;

2. 中國(guó)石油天然氣總公司中心醫(yī)院 藥劑科, 河北 廊坊, 065000;

3. 河北省廊坊市中醫(yī)醫(yī)院 藥房, 河北 廊坊, 065000;

4. 河北省廊坊市人民醫(yī)院 特需病房,河北 廊坊, 065000)

摘要:目的探討雙環(huán)醇治療大鼠慢性酒精性肝病(ALD)的可能機(jī)制。方法72只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組，各24只。模型組和干預(yù)組分別給予白酒灌胃造模，干預(yù)組于第4周開始每日加用雙環(huán)醇灌胃，200 mg/(kg·d), 連續(xù)給藥4周；對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。結(jié)果模型組肝臟呈進(jìn)行性肝細(xì)胞損傷壞死及脂肪變性，干預(yù)組給藥后病變程度顯著輕于模型組大鼠。模型組第6、8周肝臟谷胱甘肽(GSH)含量及乙醛脫氫酶(ALDH)活性低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。干預(yù)組第6周GSH含量低于對(duì)照組，高于模型組(P<0.05), 第8周GSH含量及乙醇脫氫酶(ADH)、ALDH活性均高于模型組(P<0.05)。第6周，模型組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01); 干預(yù)組大鼠TG低于模型組(P<0.01)。第8周，模型組大鼠血清各指標(biāo)與對(duì)照組差異顯著(P<0.05); 干預(yù)組上述各指標(biāo)與模型組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論雙環(huán)醇能有效抑制ALD導(dǎo)致的肝臟脂肪堆積，對(duì)酒精引起的肝組織、肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷及肝功能損傷具有良好的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:雙環(huán)醇; 慢性酒精性肝病; 肝細(xì)胞; 脂肪變性

慢性酒精性肝病(ALD)是由于長(zhǎng)期過(guò)度飲酒引起的肝臟中毒性疾病，表現(xiàn)多樣，初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，可進(jìn)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化[1-3], 嚴(yán)重時(shí)可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚或肝功能衰竭，目前中國(guó)ALD發(fā)病率有增多趨勢(shì)。雙環(huán)醇對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性肝損傷均有顯著保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能為抑制化學(xué)毒物引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，提高肝內(nèi)谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶等自身抗氧化物含量，維持肝細(xì)胞線粒體膜流動(dòng)性，加速毒性物質(zhì)的代謝清除等[4]。本研究建立了大鼠慢性酒精性肝損傷模型，觀察雙環(huán)醇對(duì)ALD大鼠的保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量180～200 g, 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，動(dòng)物許可證編號(hào)NO.SCXK(京)2007-0001。標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.2　實(shí)驗(yàn)材料

雙環(huán)醇(純度>99%，購(gòu)自北京協(xié)和藥廠)，市售56°白酒，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、GSH、乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司，膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.3　造模及分組

SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和干預(yù)組，各24只，每周測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量。模型組大鼠每日給予白酒灌胃，劑量為10 mL/kg, 2次/d, 間隔8 h, 持續(xù)8周；干預(yù)組大鼠每日以相同方式以白酒灌胃，并于第4周開始每日以雙環(huán)醇灌胃，劑量為200 mg/(kg·d), 連續(xù)給藥4周；對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，持續(xù)8周。

1.4　肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察

各組第6、8周最后一次給藥后取大鼠12只禁食12 h，取血并進(jìn)行生化和酶活性檢測(cè)，斷頭處死，進(jìn)行肝臟形態(tài)學(xué)觀察。處死大鼠后，迅速開胸取出完整肝臟，迅速切取適量肝臟組織，5%戊二醛固定，石蠟包埋，常規(guī)HE染色，鏡下觀察。余肝臟置于-4 ℃冰箱保存。

1.5　肝臟GSH含量、ADH、ALDH活性測(cè)定

取出肝臟，制備10%肝勻漿。嚴(yán)格按照GSH測(cè)定試劑盒操作，于412 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH含量。取200 μL肝勻漿與等體積0.3%脫氧膽酸鈉溶液混勻冰浴20 min，4 000 g離心10 min，取上清液。嚴(yán)格按照ADH及ALDH測(cè)定試劑盒操作，于37 ℃下340 nm的波長(zhǎng)連續(xù)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)光密度變化值計(jì)算ADH活性，于25 ℃下340 nm的波長(zhǎng)連續(xù)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)光密度變化值計(jì)算ALDH活性。

1.6　血清相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)

嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明，于第6、8周采用分光光度法分別檢測(cè)血清ALT、TG、TC、HDL-C及LDL-C含量。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　各組大鼠生理狀態(tài)比較

模型組大鼠均出現(xiàn)飲食減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩，毛發(fā)無(wú)光澤，部分脫落；白酒灌胃10 min后，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、眼球充血、嗜睡等癥狀，30 min～2 h后可恢復(fù)常態(tài)。干預(yù)組大鼠給藥前癥狀與模型組大鼠相似，給藥后體質(zhì)量增長(zhǎng)加快，行動(dòng)較為敏捷靈活，毛發(fā)有光澤；對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好，飲食正常，毛發(fā)有光澤，反應(yīng)靈敏。

2.2　肝臟形態(tài)觀察

對(duì)照組大鼠肝竇結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉規(guī)則，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組大鼠酒精灌胃6周后，中央靜脈輕度擴(kuò)張，中央靜脈周圍肝細(xì)胞水腫，不同程度空泡變性，可見(jiàn)小灶壞死和脂肪滴；8周后，中央靜脈壁增厚并出現(xiàn)血栓，肝組織膠原纖維增生，空泡變性加重，大量脂肪滴產(chǎn)生，肝小葉可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。干預(yù)組大鼠第6周肝細(xì)胞輕度水腫，少量空泡變性及脂肪滴；第8周肝組織空泡變性減少，脂肪滴較少，體積減小。

2.3　3組大鼠肝臟GSH、ADH、ALDH活性比較

3組第6、8周組內(nèi)比較，各指標(biāo)均無(wú)顯著變化(P>0.05)。模型組第6、8周GSH含量及ALDH活性低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01), ADH活性低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)組第6周GSH含量低于對(duì)照組，高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第8周GSH含量及ADH、ALDH活性均高于模型組(P<0.05)，與對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別時(shí)間/周GSH/(nmol/gprot)ADH/(U/mgprot)ALDH/(U/mgprot)對(duì)照組(n=12)66.33±0.527.29±1.268.67±1.0586.29±0.687.33±1.428.58±0.85模型組(n=12)64.51±1.42**6.32±1.267.68±1.21*84.15±2.05**6.01±1.757.21±2.01*干預(yù)組(n=12)65.64±1.01*#6.98±1.368.04±1.4185.88±1.30##7.92±1.37##8.85±1.73#

與同一時(shí)間對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與同一時(shí)間模型組比較，##P<0.01。

2.4　3組血清ALT、TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較

第6周，模型組大鼠血清ALT、TG、TC、LDL-C含量高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)；干預(yù)組大鼠ALT高于對(duì)照組(P<0.05), TG低于模型組(P<0.01)。第8周，模型組大鼠血清ALT、TG、TC、LDL-C含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01), HDL-C含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05); 干預(yù)組大鼠TC含量低于對(duì)照組，HDL-C含量高于對(duì)照組，ALT、TG、LDL-C含量顯著低于模型組, HDL-C含量高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

組別時(shí)間/周ALT/(U/L)TG/(mmol/L)TC/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)對(duì)照組(n=12)634.67±6.422.64±0.152.71±0.345.52±0.950.92±0.15835.22±5.532.58±0.132.74±0.365.64±1.220.93±0.14模型組(n=12)646.36±10.52**3.27±0.18**3.12±0.57*5.02±1.111.17±0.25**867.82±13.64**3.64±0.22**3.55±0.62**4.35±1.20*1.35±0.34**干預(yù)組(n=12)642.76±10.22*2.73±0.21##3.02±0.665.22±0.861.02±0.33838.42±6.74##2.65±0.14##2.67±0.54*##7.34±2.42*##0.95±0.21##

與同一時(shí)間對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與同一時(shí)間模型組比較，#P<0.05, ##P<0.01。

3討論

雙環(huán)醇對(duì)化療藥物性肝損傷、酒精性肝損傷、脂肪肝、肝部分切除及缺血再灌注肝損傷，以及免疫性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞內(nèi)紊亂的氧化還原平衡體系，抑制炎癥物質(zhì)生成及脂質(zhì)過(guò)氧化、改善肝脂蛋白分泌及轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)[5-6]。目前為止，慢性酒精性肝損傷的發(fā)生機(jī)制未完全闡明。大部分學(xué)者認(rèn)為長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)造成微粒體乙醇氧化系統(tǒng)代謝產(chǎn)物增多，自由基大量生成，體內(nèi)氧化還原平衡體系被打破，肝細(xì)胞氧化損傷[7]。同時(shí)體內(nèi)細(xì)胞毒性物質(zhì)乙醛生成量累積增加，加劇肝細(xì)胞膜以及微管損傷[8]。乙醇及乙醛的代謝可產(chǎn)生大量NADHM, 導(dǎo)致脂肪代謝紊亂，無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，導(dǎo)致脂肪滴在肝細(xì)胞積聚形成。

丁光偉等[9]的臨床研究顯示，雙環(huán)醇能夠顯著降低酒精性肝炎患者的ALT、AST、總膽紅素(TBIL)、r-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，有效率達(dá)95.2%。雙環(huán)醇可通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞膜和線粒體、清除氧自由基、使肝細(xì)胞核DNA免受損傷及減少凋亡進(jìn)而起到保肝作用。本研究使用56°白酒進(jìn)行大鼠灌胃，成功建立了大鼠ALD模型[10]。結(jié)果可見(jiàn)，造模后肝細(xì)胞組織形態(tài)觀察見(jiàn)明顯腫脹和脂肪變性進(jìn)行性加重，血清ALT持續(xù)升高，小葉中央靜脈肝擴(kuò)張。雙環(huán)醇給藥明顯減輕酒精引起的肝細(xì)胞損及壞死，血清ALT呈下降趨勢(shì)，肝臟脂肪變和細(xì)胞腫脹等病理改變明顯改善[11-12]。

乙醇可動(dòng)員外周脂肪分解，血液脂肪酸含量升高，使肝臟TG合成大量增加。此外，酒精可誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞色素P450表達(dá)，進(jìn)而加重酒精代謝產(chǎn)物的肝毒性，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪攝取增多，形成脂肪肝[13-14]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟TG顯著升高，給予雙環(huán)醇后TG水平下降顯著。同時(shí)，雙環(huán)醇還可降低血清TC和LDL-C，升高HDL-C增加肝臟脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)，與蘇振和[12]的研究一致，表明雙環(huán)醇可有效抑制ALD導(dǎo)致的肝臟脂肪堆積，而其作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

酒精主要經(jīng)肝臟ADH/ALDH代謝，酒精使ALDH活性降低，乙醛代謝下降[15-16]。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化物，清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基。本研究中模型組大鼠給予酒精后，肝臟ADH以及ALDH活性進(jìn)行性降低，GSH水平顯著下降。雙環(huán)醇口服給藥可通過(guò)誘導(dǎo)肝胞漿ADH及ALDH表達(dá)和激活，加速乙醛代謝清除，使GSH恢復(fù)至正常水平，與莫成林等[17]研究一致，表明雙環(huán)醇可促進(jìn)GSH的再生，增強(qiáng)肝臟自由基的清除能力。

綜上所述，雙環(huán)醇不僅能有效抑制慢性酒精性肝損傷導(dǎo)致的肝臟脂肪堆積，保護(hù)肝竇組織、肝臟細(xì)胞、肝小葉中央靜脈結(jié)構(gòu)等，對(duì)酒精引起的GSH含量下降、ALDH活性及ALT活性下降等也具有明顯改善作用，可抑制ALD引起的肝臟纖維化變性及壞死[18-19]。

參考文獻(xiàn)

[1]Dvorak R D, Pearson M R, Day A M. Ecological momentary assessment of acute alcohol use disorder symptoms: associations with mood, motives, and use on planned drinking days[J]. Exp Clin Psychopharmacol, 2014, 22(4): 285.

[2]王洪巖, 李鑫, 徐有青. 酒精性肝病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用肝臟病雜志, 2014, 17(1): 5.

[3]Cojocariu C E, Trifan A V, G?rleanu I, et al. Alcoholic liver disease-epidemiology and risk factors[J]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 2014, 118(4): 910.

[4]Li X, Zhou J, Chen S, et al. Role of bicyclol in preventing chemotherapeutic agent-induced liver injury in patients over 60 years of age with cancer[J]. J Int Med Res, 2014, 42(4): 906.

[5]王宇明, 李燕. 雙環(huán)醇保肝抗炎藥理機(jī)制研究新進(jìn)展[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2010, 19(7): 674.

[6]Han Y, Shi J P, Ma A L, et al. Randomized, vitamin E-controlled trial of bicyclol plus metformin in non-alcoholic fatty liver disease patients with impaired fasting glucose[J]. Clin Drug Investig, 2014, 34(1): 1.

[7]García-Ruiz C, Kaplowitz N, Fernandez-Checa J C. Role of mitochondria in alcoholic liver disease[J]. Curr Pathobiol Rep, 2013, 1(2): 159.

[8]李秀歌, 李慈莉. 乙醇誘導(dǎo)肝損傷作用機(jī)制概述[J]. 中國(guó)藥師, 2008, 11(9): 1114.

[9]丁光偉, 高春耕. 雙環(huán)醇治療酒精性肝炎的臨床觀察[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2012, 7(26): 180.

[10]Lieber C S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis[J]. Alcohol, 2004, 34(1): 9.

[11]王艷春, 沈吉云. 美他多辛聯(lián)合多烯磷脂酰膽堿治療酒精性肝病的療效觀察[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2014, 18(5): 87.

[12]申蘇建, 夏宣平, 閆峻, 等. 乙酰半胱氨酸治療重癥酒精性肝炎的療效評(píng)價(jià)[J]. 中華全科醫(yī)學(xué), 2014, 12(12): 1953.

[13]康曉琳, 薛永志, 武潤(rùn)生, 等. 酒精性肝損傷大鼠細(xì)胞色素 P450 CYP2E1 和細(xì)胞色素 P450 CYP3A 的代謝活性[J]. 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2010, 24, (4): 286.

[14]蘇振和. 雙環(huán)醇治療酒精性肝病 32 例臨床觀察[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2011, 38(14): 2892.

[15]何震宇, 陳亮明. 酒精代謝關(guān)鍵酶乙醛脫氫酶2基因分型方法研究進(jìn)展[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 29(6): 682.

[16]Rehm J, Shield K D. Global alcohol-attributable deaths from cancer, liver cirrhosis, and injury in 2010[J]. Alcohol Res, 2013, 35(2): 174.

[17]莫成林, 李燁, 李燕. 雙環(huán)醇對(duì)小鼠慢性酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 85(48): 3409.

[18]曾雯潔. 湛江地區(qū)1986例健康體檢者B超檢查結(jié)果分析[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 16(1): 99.

[19]張穎, 曾朝陽(yáng), 田曉年, 等. 雙環(huán)醇聯(lián)合二甲雙胍對(duì)2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝肝功能及糖代謝的影響[J]. 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 36(6): 598.

Exploration on mechanism of bicyclol in the

treatment of rats with chronic ALD

DONG Li1, WANG Jian2, JIA Chenhong3, GUO Linna4

(1.DepartmentofPharmacy,People′sHospitalofLangfangCity,Langfang,Hebei, 065000;

2.DepartmentofPharmacy,CNPCCentralHospital,Langfang,Hebei, 065000;

3.PharmacyRoom,LangfangTCMHospital,Langfang,Hebei, 065000;

4.SpecialHospitalWard,Peoples′HospitalofLangfangCity,Langfang,Hebei, 065000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the potential mechanism of bicyclol in the treatment of rats with chronic alcoholic liver disease (ALD). MethodsA total of 72 SD rats with chronic ALD were randomly divided into control group, model group and intervention group, 24 cases for each group. Model group and intervention group were gavaged with white wine to establish ALD models, after which intervention group was gavaged with bicyclol 200 mg/(kg·d) from the fourth week, for continuously 4 weeks, while control group was given isometric normal saline. ResultsLivers in model group showed aggressive hepatocyte injury, necrosis and fatty degeneration, and the severity of liver lesion was less in intervention group after treatment than that in model group. The liver glutathione (GSH) content and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) activity were evidently lower in model group after 6 and 8 weeks than in control group (P<0.05 orP<0.01). Intervention group was markedly lower than control group but higher than model group in GSH content after 6-week treatment (P<0.05), and was obviously higher in GSH content and alcohol dehydrogenase (ADH) and ALDH activities than model group after 8-week treatment (P<0.05). 6 weeks after treatment, model group was markedly higher than control group in serum alanine transaminase (ALT), cholesterol (TG), triglyceride (TC) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) levels (P<0.05 orP<0.01), and intervention group was apparently lower than model group in TG level (P<0.01). 8 weeks after treatment, there were significant differences between model group and control group in the levels of all serum indexes (P<0.05), so did the differences between model group and intervention group (P<0.05 orP<0.01). ConclusionBicyclol can effectively inhibit the accumulation of ALD-induced liver fat and has favorable protective function on alcohol-induced injury of hepatic tissues, hepatocyte structure and hepatic function.

KEYWORDS:bicyclol; chronic alcoholic liver disease; hepatocyte; fatty degeneration

基金項(xiàng)目:中國(guó)高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11522940)

收稿日期:2015-01-16

中圖分類號(hào):R 575

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)15-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201515001