劉云龍，宋 卓，彭冰潔，許詩豪，朱 琪，王 征

(湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙 410128)

研究顯示，肝細胞凋亡在非酒精性脂肪肝形成和發(fā)展中起著十分關鍵的作用［1，2］。Fas/FasL 途徑是機體行使正常生理功能不可或缺的一部分，正常情況下FasL表達量很低，但當處于病理狀態(tài)下時，F(xiàn)asL 表達量升高，通過Fas/FasL 途徑調控細胞凋亡。Fas/FasL 途徑在肝臟疾病發(fā)生、腫瘤的控制以及免疫系統(tǒng)的維持等方面均扮演著重要的角色［3，4］。綠原酸具有調節(jié)血糖濃度與脂代謝，治療胰島素抵抗以及清除過氧自由基等功能，但對于綠原酸是否具有抗細胞凋亡作用以及對肝細胞是否具有保護作用的研究報道較少［5，6］。本文通過給予大鼠長期飼喂高脂飼料的方法建立非酒精性脂肪肝的凋亡模型，經綠原酸干預，研究綠原酸對肝細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

體重210～230g SPF 級的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠40 只，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;綠原酸，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;Trizol，美國Invirtrogen 公司;反轉錄試劑盒，天根生化科技有限公司;PCR mix，天根生化科技有限公司;TC 試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;TG 試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;HDL-C，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;LDL-C 測定試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。飼料:普通飼料見表1，總能量為3 520kcal/kg;高脂飼料見表2，總能量為4 976.51kcal/kg，均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司生產。

表1 普通飼料配方

表2 高脂飼料配方

1.2 實驗方法

1.2.1 分組和建模 SD 大鼠7d 適應期喂養(yǎng)后，將其隨機分成4 組:空白對照組(NC 組)、模型組(HFD組)、低劑量綠原酸防治組(HFD-LC 組)和高劑量綠原酸防治組(HFD-HC 組)。NC 組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高脂飼料，自由飲水攝食。其中，依據個體的體重，HFD-LC 和HFD-HC 組分別按照綠原酸20、90mg/(kg·d)劑量進行灌胃;NC 組和HFD 組則每天灌胃等體積超純水。每天09:30 定時測定大鼠體重，12w后處死，測量各項生理生化指標。

1.2.2 血清中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量的測定采用眼球取血法，取血后將血液靜置2 h，2 000 r/min，離心15 min，分離得到血清，按照試劑盒說明書依次檢測各項數據。

1.2.3 RT-PCR 檢測肝臟凋亡相關因子mRNA 表達量

TRIZOL 法提取肝臟組織RNA，用微量光度計檢測純度和含量;取1g RNA，按照試劑盒步驟反轉成cDNA(體積20L);以cDNA 做為模板進行PCR 擴增。采用Primer Premier 5.0 設計引物，GAPDH 作為管家基因。PCR 反應體系:cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總計25 μL。反應條件如下:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增29 個循環(huán);最后再在72 ℃保持5 min。PCR 擴增產物用1 % 瓊脂糖凝膠電泳30～40 min，使用凝膠自動成像系統(tǒng)掃描拍照，并用Quantity One 進行相對表達率的半定量分析。

1.2.4 肝臟切片HE 染色 取大鼠肝組織，用10 %甲醛溶液固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切成3～5 μm 的厚切片，脫蠟，先后用蘇木精和伊紅染色，脫水，透明，封片，電鏡下觀察肝臟細胞形態(tài)學變化。

1.2.5 數據分析 應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異比較采用單因素方差分析，所有數據均以±s表示，P＜0.05 時，認為具有顯著性差異;P＜0.01 時，認為具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 綠原酸對大鼠體重的影響

由表3 可知，飼喂12w 后，相比于HFD 組，HFD-HC組大鼠體重及體重增加量顯著降低，其他均無顯著差異。

表3 綠原酸對大鼠體重的影響 單位:g

2.2 綠原酸對大鼠肝濕重和肝指數的影響

由表4 可見，相比于NC 組，HFD 組大鼠肝濕重和肝指數極顯著增加(P＜0.01);相比于HFD 組，HFDLC 組和HFD-HC 組的肝濕重顯著降低(P＜0.05)。

表4 綠原酸對大鼠肝濕量和肝指數的影響

2.3 綠原酸對大鼠血清中TC、TG 、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C 的影響

由表5 可知，與NC 組相比，HFD 組HDL-C 和FFA含量顯著增加，TC 和LDL-C 含量極顯著增加。與HFD 組相比，HFD-LC 組的TC 和FFA 含量顯著下降;HFD-HC組的HDL-C 和FFA 含量顯著下降，TC 和LDL-C 含量極顯著下降，HDL-C/LDL-C 的值顯著升高。

表5 綠原酸干預對大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C 的影響

2.4 綠原酸對肝細胞內Fas、FasL 以及Caspase-8 表達量的影響

由圖1 可知，與NC 組相比，HFD 組肝臟組織中Fas 和Fasl 表達量極顯著性升高，Caspase-8 表達量顯著性升高;與HFD 組相比，HFD-LC 組肝臟組織中Fas、Fasl 和Caspase-8 表達量均有降低，但差異性不顯著，HFD-HC 組肝臟組織中Fas 和Fasl 表達量顯著性降低，Caspase-8 表達量有所降低，但差異性不顯著。

2.5 綠原酸對大鼠肝組織病理形態(tài)學變化的影響

由圖2 可知，NC 組細胞形態(tài)結構正常，各細胞大小一致且排列緊密，細胞之間空隙較少，細胞質分布均勻，無脂肪空泡，胞核清晰明顯無破碎現(xiàn)象。與NC 組對比，HFD 組細胞膨脹變大呈圓形(圖中箭頭所示)，細胞核染色加深并碎裂成多個小核，胞質中充滿大量的脂肪性空泡等病理癥狀。與HFD 組相比，HFD-LC 組中空泡數量減少、胞質分布較均勻，細胞核破碎現(xiàn)象減少，病理癥狀有所改善;HFD-HC 組細胞形態(tài)則與NC組相似，胞質中幾乎無大型脂肪空泡出現(xiàn)，細胞核結構也更加完整。

3 討論

對脂肪肝模型的建立，科研人員也常常是通過給動物長期飼喂高脂飼料而實現(xiàn)的［7］。長期的高脂飲食將會導致體重與肝臟重量的增加，血液中TC、TG 以及HDLC/ LDL-C 值的減少。HFD 組中TG 與TC 值的升高說明機體出現(xiàn)高血糖和高血脂癥狀，HDL-C/ LDL-C 值的減少說明肝臟轉運膽固醇能力下降。當攝入脂肪量超過肝臟對脂肪的分解與轉運能力之后，將會導致脂肪在肝臟組織的堆積，進而引發(fā)脂肪肝。通過綠原酸干預后發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠有效降低體重與肝重量，調節(jié)糖脂代謝，降低血糖與血脂含量，并且升高HDL-C/ LDL-C 的值，這與Meng S 等［8］所發(fā)現(xiàn)的綠原酸能夠調節(jié)體內血糖血脂平衡，促進脂肪代謝等結論一致。

非酒精性脂肪肝的發(fā)病與肥胖、高脂血癥、糖尿病等有關，其主要表現(xiàn)為肝臟細胞的脂肪變性，肝細胞內出現(xiàn)大量的空泡為主要特征的病理癥狀［9-10］。以往對非酒精性脂肪肝的研究主要集中在胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、以及氧化應激等［11-12］。肝細胞凋亡是許多肝病的共同發(fā)病機制之一，F(xiàn)eldstein A E 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝將導致機體肝細胞的凋亡，同時還有研究顯示，肝細胞凋亡的程度隨著脂肪肝的加劇細胞凋亡數目進一步增多［14］。Fas/FasL 途徑介導的信號通路是細胞凋亡通路的主要的途徑之一，在此途徑中，細胞膜表面存在受體Fas，由于各種理化因素導致配體FasL 表達量上升，當配體FasL 與其相應受體Fas 相結合時將會誘導Fas 胞漿內部分與FADD 接頭蛋白形成三聚體，當三聚體形成后，再將凋亡信號傳遞給Caspase-8 蛋白酶原，Caspase-8 蛋白酶原經過自我催化修飾轉變?yōu)榫哂谢钚缘腃aspase-8，繼而通過級聯(lián)反應激活下游的其他效應蛋白酶而最終誘導肝細胞凋亡［15-16］。本實驗發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食將會導致肝細胞FasL、Fas 以及Caspase-8 表達量的上升，繼而引發(fā)肝細胞凋亡，經綠原酸干預后，F(xiàn)asL、Fas 以及Caspase-8 表達量明顯下降，其原因可能為:長期的高脂將會加重肝細胞的氧化分解負擔，肝細胞進行氧化分解反應的同時會產生大量的代謝中間產物，特別是一些活性氧和自由基，當這些活性氧與自由基含量超過肝細胞的消除能力時，將會引起肝細胞氧化應激現(xiàn)象，進而激活Fas/FasL 系統(tǒng)，最終導致肝細胞發(fā)生凋亡。

4 結論

一定劑量的綠原酸能夠調節(jié)糖脂代謝，控制機體體重，有效緩解因長期高脂飲食所導致的非酒精性脂肪肝癥狀。綠原酸還能通過Fas/FasL 系統(tǒng)與Caspase-8 調控肝細胞的增殖與凋亡，表明綠原酸對肝細胞具有一定的調節(jié)作用，并且高劑量作用效果更加明顯。

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