劉云龍，宋 卓，彭冰潔，許詩豪，朱 琪，王 征

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128)

研究顯示，肝細(xì)胞凋亡在非酒精性脂肪肝形成和發(fā)展中起著十分關(guān)鍵的作用［1，2］。Fas/FasL 途徑是機(jī)體行使正常生理功能不可或缺的一部分，正常情況下FasL表達(dá)量很低，但當(dāng)處于病理狀態(tài)下時(shí)，F(xiàn)asL 表達(dá)量升高，通過Fas/FasL 途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡。Fas/FasL 途徑在肝臟疾病發(fā)生、腫瘤的控制以及免疫系統(tǒng)的維持等方面均扮演著重要的角色［3，4］。綠原酸具有調(diào)節(jié)血糖濃度與脂代謝，治療胰島素抵抗以及清除過氧自由基等功能，但對(duì)于綠原酸是否具有抗細(xì)胞凋亡作用以及對(duì)肝細(xì)胞是否具有保護(hù)作用的研究報(bào)道較少［5，6］。本文通過給予大鼠長期飼喂高脂飼料的方法建立非酒精性脂肪肝的凋亡模型，經(jīng)綠原酸干預(yù)，研究綠原酸對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

體重210～230g SPF 級(jí)的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠40 只，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;綠原酸，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;Trizol，美國Invirtrogen 公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技有限公司;PCR mix，天根生化科技有限公司;TC 試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;TG 試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;HDL-C，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;LDL-C 測定試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。飼料:普通飼料見表1，總能量為3 520kcal/kg;高脂飼料見表2，總能量為4 976.51kcal/kg，均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司生產(chǎn)。

表1 普通飼料配方

表2 高脂飼料配方

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組和建模 SD 大鼠7d 適應(yīng)期喂養(yǎng)后，將其隨機(jī)分成4 組:空白對(duì)照組(NC 組)、模型組(HFD組)、低劑量綠原酸防治組(HFD-LC 組)和高劑量綠原酸防治組(HFD-HC 組)。NC 組飼喂普通飼料，其余各組飼喂高脂飼料，自由飲水?dāng)z食。其中，依據(jù)個(gè)體的體重，HFD-LC 和HFD-HC 組分別按照綠原酸20、90mg/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃;NC 組和HFD 組則每天灌胃等體積超純水。每天09:30 定時(shí)測定大鼠體重，12w后處死，測量各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.2.2 血清中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量的測定采用眼球取血法，取血后將血液靜置2 h，2 000 r/min，離心15 min，分離得到血清，按照試劑盒說明書依次檢測各項(xiàng)數(shù)據(jù)。

1.2.3 RT-PCR 檢測肝臟凋亡相關(guān)因子mRNA 表達(dá)量

TRIZOL 法提取肝臟組織RNA，用微量光度計(jì)檢測純度和含量;取1g RNA，按照試劑盒步驟反轉(zhuǎn)成cDNA(體積20L);以cDNA 做為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物，GAPDH 作為管家基因。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總計(jì)25 μL。反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增29 個(gè)循環(huán);最后再在72 ℃保持5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1 % 瓊脂糖凝膠電泳30～40 min，使用凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)掃描拍照，并用Quantity One 進(jìn)行相對(duì)表達(dá)率的半定量分析。

1.2.4 肝臟切片HE 染色 取大鼠肝組織，用10 %甲醛溶液固定24h，常規(guī)石蠟包埋，切成3～5 μm 的厚切片，脫蠟，先后用蘇木精和伊紅染色，脫水，透明，封片，電鏡下觀察肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為具有顯著性差異;P＜0.01 時(shí)，認(rèn)為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸對(duì)大鼠體重的影響

由表3 可知，飼喂12w 后，相比于HFD 組，HFD-HC組大鼠體重及體重增加量顯著降低，其他均無顯著差異。

表3 綠原酸對(duì)大鼠體重的影響 單位:g

2.2 綠原酸對(duì)大鼠肝濕重和肝指數(shù)的影響

由表4 可見，相比于NC 組，HFD 組大鼠肝濕重和肝指數(shù)極顯著增加(P＜0.01);相比于HFD 組，HFDLC 組和HFD-HC 組的肝濕重顯著降低(P＜0.05)。

表4 綠原酸對(duì)大鼠肝濕量和肝指數(shù)的影響

2.3 綠原酸對(duì)大鼠血清中TC、TG 、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C 的影響

由表5 可知，與NC 組相比，HFD 組HDL-C 和FFA含量顯著增加，TC 和LDL-C 含量極顯著增加。與HFD 組相比，HFD-LC 組的TC 和FFA 含量顯著下降;HFD-HC組的HDL-C 和FFA 含量顯著下降，TC 和LDL-C 含量極顯著下降，HDL-C/LDL-C 的值顯著升高。

表5 綠原酸干預(yù)對(duì)大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、HDL-C/LDL-C 的影響

2.4 綠原酸對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)Fas、FasL 以及Caspase-8 表達(dá)量的影響

由圖1 可知，與NC 組相比，HFD 組肝臟組織中Fas 和Fasl 表達(dá)量極顯著性升高，Caspase-8 表達(dá)量顯著性升高;與HFD 組相比，HFD-LC 組肝臟組織中Fas、Fasl 和Caspase-8 表達(dá)量均有降低，但差異性不顯著，HFD-HC 組肝臟組織中Fas 和Fasl 表達(dá)量顯著性降低，Caspase-8 表達(dá)量有所降低，但差異性不顯著。

2.5 綠原酸對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響

由圖2 可知，NC 組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，各細(xì)胞大小一致且排列緊密，細(xì)胞之間空隙較少，細(xì)胞質(zhì)分布均勻，無脂肪空泡，胞核清晰明顯無破碎現(xiàn)象。與NC 組對(duì)比，HFD 組細(xì)胞膨脹變大呈圓形(圖中箭頭所示)，細(xì)胞核染色加深并碎裂成多個(gè)小核，胞質(zhì)中充滿大量的脂肪性空泡等病理癥狀。與HFD 組相比，HFD-LC 組中空泡數(shù)量減少、胞質(zhì)分布較均勻，細(xì)胞核破碎現(xiàn)象減少，病理癥狀有所改善;HFD-HC 組細(xì)胞形態(tài)則與NC組相似，胞質(zhì)中幾乎無大型脂肪空泡出現(xiàn)，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)也更加完整。

3 討論

對(duì)脂肪肝模型的建立，科研人員也常常是通過給動(dòng)物長期飼喂高脂飼料而實(shí)現(xiàn)的［7］。長期的高脂飲食將會(huì)導(dǎo)致體重與肝臟重量的增加，血液中TC、TG 以及HDLC/ LDL-C 值的減少。HFD 組中TG 與TC 值的升高說明機(jī)體出現(xiàn)高血糖和高血脂癥狀，HDL-C/ LDL-C 值的減少說明肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇能力下降。當(dāng)攝入脂肪量超過肝臟對(duì)脂肪的分解與轉(zhuǎn)運(yùn)能力之后，將會(huì)導(dǎo)致脂肪在肝臟組織的堆積，進(jìn)而引發(fā)脂肪肝。通過綠原酸干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠有效降低體重與肝重量，調(diào)節(jié)糖脂代謝，降低血糖與血脂含量，并且升高HDL-C/ LDL-C 的值，這與Meng S 等［8］所發(fā)現(xiàn)的綠原酸能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖血脂平衡，促進(jìn)脂肪代謝等結(jié)論一致。

非酒精性脂肪肝的發(fā)病與肥胖、高脂血癥、糖尿病等有關(guān)，其主要表現(xiàn)為肝臟細(xì)胞的脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡為主要特征的病理癥狀［9-10］。以往對(duì)非酒精性脂肪肝的研究主要集中在胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、以及氧化應(yīng)激等［11-12］。肝細(xì)胞凋亡是許多肝病的共同發(fā)病機(jī)制之一，F(xiàn)eldstein A E 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝將導(dǎo)致機(jī)體肝細(xì)胞的凋亡，同時(shí)還有研究顯示，肝細(xì)胞凋亡的程度隨著脂肪肝的加劇細(xì)胞凋亡數(shù)目進(jìn)一步增多［14］。Fas/FasL 途徑介導(dǎo)的信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡通路的主要的途徑之一，在此途徑中，細(xì)胞膜表面存在受體Fas，由于各種理化因素導(dǎo)致配體FasL 表達(dá)量上升，當(dāng)配體FasL 與其相應(yīng)受體Fas 相結(jié)合時(shí)將會(huì)誘導(dǎo)Fas 胞漿內(nèi)部分與FADD 接頭蛋白形成三聚體，當(dāng)三聚體形成后，再將凋亡信號(hào)傳遞給Caspase-8 蛋白酶原，Caspase-8 蛋白酶原經(jīng)過自我催化修飾轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘腃aspase-8，繼而通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的其他效應(yīng)蛋白酶而最終誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡［15-16］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食將會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞FasL、Fas 以及Caspase-8 表達(dá)量的上升，繼而引發(fā)肝細(xì)胞凋亡，經(jīng)綠原酸干預(yù)后，F(xiàn)asL、Fas 以及Caspase-8 表達(dá)量明顯下降，其原因可能為:長期的高脂將會(huì)加重肝細(xì)胞的氧化分解負(fù)擔(dān)，肝細(xì)胞進(jìn)行氧化分解反應(yīng)的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的代謝中間產(chǎn)物，特別是一些活性氧和自由基，當(dāng)這些活性氧與自由基含量超過肝細(xì)胞的消除能力時(shí)，將會(huì)引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激現(xiàn)象，進(jìn)而激活Fas/FasL 系統(tǒng)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4 結(jié)論

一定劑量的綠原酸能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝，控制機(jī)體體重，有效緩解因長期高脂飲食所導(dǎo)致的非酒精性脂肪肝癥狀。綠原酸還能通過Fas/FasL 系統(tǒng)與Caspase-8 調(diào)控肝細(xì)胞的增殖與凋亡，表明綠原酸對(duì)肝細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)作用，并且高劑量作用效果更加明顯。

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