李曉菲，朱海波，高 奇，王 琦，孫佳善，高玉龍，祁小樂(lè)，王永強(qiáng)，高宏雷，王笑梅*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽免疫抑制病科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱動(dòng)物用生物制品國(guó)家工程研究中心有限公司，黑龍江 哈爾濱 150001；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

禽白血病是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。ALV 屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，禽C 型反轉(zhuǎn)錄病毒屬。根據(jù)病毒感染的宿主范圍、干擾譜和囊膜抗原，可以將ALV 進(jìn)一步區(qū)分為A 至G 7 個(gè)亞群[1-2]。J 亞群ALV(ALV-J)最早于1988 年在英國(guó)分離得到[2]。1999 年中國(guó)首次報(bào)道ALV-J 的出現(xiàn)，繼而中國(guó)大部分地區(qū)相繼出現(xiàn)ALV 感染的報(bào)道[3-5]。ALV 大范圍的流行給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

目前，該病的主要預(yù)防方法為淘汰陽(yáng)性雞，選育出無(wú)白血病雞群以凈化種群[7]。因此，該病的準(zhǔn)確診斷尤為重要。本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)的重組衣殼蛋白(p27 蛋白)免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)最終獲得一株抗p27 蛋白的單克隆抗體(MAb)。并通過(guò)對(duì)p27蛋白的截短表達(dá)，確定了該MAb 識(shí)別的抗原表位，為禽白血病病原檢測(cè)方法的建立提供了有利的工具。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ALV-J HPRS103株、ALV-A RAV-1 株和ALV-B RAV-2 株均由英國(guó)Pirbright 研究所Dr Nair 惠贈(zèng)；DF-1、S/P20 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；6 周齡BALB/c 雌鼠由本研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 大腸桿菌(E.coli)DH5α 和BL21 感受態(tài)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pET-30a 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；PEG-4000、HPR 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)、羊抗鼠IgG-FITC 購(gòu)自Sigma 公司；抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自賽默飛公司；蛋白純化用材料購(gòu)自GE healthcare。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá) 根據(jù)ALV-J HPRS103 株的序列(Z46390)設(shè)計(jì)一對(duì)引物5'-CACGAATTCAGCGCCTGCTACGGTGGTGACCC-3'(Eco RⅠ)/5'-ACTCTCGAGGGAGTTCATCTATTGC AACAACCAG-3'(XhoⅠ)。經(jīng)PCR 擴(kuò)增p27 目的基因，通過(guò)Eco R Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切后克隆于pET-30a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-p27。將其轉(zhuǎn)化BL21 E.coli 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，制備p27重組蛋白，按照文獻(xiàn)[8]方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。

1.4 動(dòng)物免疫及細(xì)胞融合 將純化的p27 蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，對(duì)小鼠(100 μg/只)進(jìn)行頸背部皮下注射。兩周后，以弗氏不完全佐劑乳化的p27 蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。間隔兩周，用二免同樣的方法進(jìn)行第3 次免疫。三免后21 d，用純化的p27 蛋白(100 μg/只)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，3 d后，取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合[9]。

1.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選及MAb的亞類鑒定 以純化的p27 蛋白作為檢測(cè)抗原，通過(guò)間接ELISA 方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株的篩選。將篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株利用有限稀釋法進(jìn)行克隆純化3 代，直到陽(yáng)性率為100 %。將純化的雜交瘤細(xì)胞按文獻(xiàn)[11]的方法腹腔接種6 周齡～8 周齡的小鼠制備小鼠腹水MAb。并利用MAb 亞型試劑盒對(duì)其進(jìn)行亞類鑒定。具體步驟參考說(shuō)明書(shū)。

1.6 MAb的間接免疫熒光(IFA)鑒定 將ALV-A、ALV-B 和ALV-J 分別接種于DF-1 細(xì)胞單層中，連續(xù)培養(yǎng)4 d 后，將細(xì)胞單層經(jīng)無(wú)水乙醇固定15 min，以制備的MAb(1∶100)為一抗，羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)為二抗，通過(guò)顯微鏡觀察進(jìn)行IFA 鑒定。

1.7 抗原表位的初步鑒定 將p27 編碼基因分成部分重疊的6 段：p27-1(aa1-aa111)、p27-2(aa91-aa177)、p27-3(aa151-aa239)、p27-4(aa91-aa125)、p27-5(aa119-aa153)和p27-6(aa147-aa177)，PCR 擴(kuò)增后，克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1 中，陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化E.coli BL21，并以IPTG 誘導(dǎo)進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。以制備的MAb 作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP 作為二抗對(duì)表達(dá)的多肽進(jìn)行western blot鑒定，初步確定p27 抗原表位所在的區(qū)域。

將MAb 識(shí)別的p27 片段繼續(xù)進(jìn)行截短表達(dá)，并采用原核表達(dá)的肽段包被96 孔ELISA 反應(yīng)板，以制備的MAb 作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP 作為二抗檢測(cè)所表達(dá)肽段與MAb 的反應(yīng)情況，從而確定p27抗原表位所在的位置。

2 結(jié)果

2.1 p27蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定 以ALV-J HPRS103 cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增p27 目的基因，并通過(guò)雙酶切后克隆于pET-30a 質(zhì)粒中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-p27。將pET-p27 轉(zhuǎn)化E.coli BL21后，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)獲得可溶性表達(dá)的重組p27 蛋白。重組蛋白經(jīng)過(guò)純化后，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果顯示其分子量為36 ku，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 重組蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant p27 protein expression

2.2 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的建立、MAb效價(jià)測(cè)定及MAb免疫球蛋白亞類鑒定 以原核表達(dá)的重組p27蛋白為免疫原免疫小鼠后，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)間接ELISA 篩選陽(yáng)性克隆以及3 次雜交瘤細(xì)胞克隆純化，最終獲得一株持續(xù)分泌ALV p27 蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2C7。采用已建立的間接ELISA 方法對(duì)2C7 進(jìn)行MAb 效價(jià)測(cè)定，結(jié)果顯示小鼠腹水的效價(jià)為212。其IgG 亞型為IgG1/Kappa。

2.3 MAb的特異性鑒定 將純化的重組蛋白進(jìn)行western blot 鑒定。結(jié)果顯示，在36 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，而空載體對(duì)照未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。表明MAb 2C7 能夠識(shí)別ALV 的衣殼蛋白p27(圖2A)。

將ALV-A、ALV-B 和ALV-J 分別接種于DF-1細(xì)胞，未接毒的DF-1 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。接毒后4 d以MAb 2C7 作為一抗，進(jìn)行IFA 試驗(yàn)。IFA 試驗(yàn)結(jié)果表明，制備的MAb 2C7 與ALV-A，ALV-B 和ALV-J 均呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖2B)，表明該MAb 能夠與不同亞群的ALV 反應(yīng)。

圖2 MAb 的western blot 和IFA 鑒定Fig.2 Identification of the MAb by western blot(A)and IFA(B)

2.4 MAb線性抗原表位的鑒定 將p27 編碼基因分成部分重疊的6 段：p27-1(aa1-aa111)、p27-2(aa91-aa177)、p27-3(aa151-aa239)、p27-4(aa91-aa125)、p27-5(aa119-aa153)和p27-6(aa147-aa177)分別克隆于pGEX-6P-1 中進(jìn)行原核表達(dá)。以MAb 2C7為一抗，對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行western blot 驗(yàn)證。結(jié)果顯示，重組蛋白p27-5 能夠與MAb 2C7 發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3)。表明p27 蛋白的抗原表位可以初步確定在aa119～aa153 之間。

將p27-5 進(jìn)一步進(jìn)行截短表達(dá)p27-7(aa119-aa134)、p27-8(aa129-aa142)和p27-9(aa137-aa153)，利用表達(dá)的肽段包被96 孔ELISA 檢測(cè)板，以MAb 2C7 作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP 作為二抗進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明多肽p27-8 能夠與MAb 2C7 發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)。結(jié)果表明p27 蛋白的抗原表位可以進(jìn)一步確定為129LVAITASALQAFRE142。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，本研究鑒定的p27線性表位在ALV-A、ALV-B 和ALV-J 亞群之間高度保守。因此，該表位對(duì)于ALV 群特異性抗原檢測(cè)試劑盒的研究具有重要意義。

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE 及western blot 分析Fig.3 SDS-PAGE(A)and western blot(B)analysis of the recombinant proteins

3 討論

圖4 重組蛋白的ELISA 分析Fig.4 ELISA analysis of the recombinant proteins

p27 蛋白是病毒衣殼蛋白，在外源性ALV-A、ALV-B 和ALV-J 各亞群間同源性高達(dá)90%，含量高，占病毒總蛋白成分的30 %以上，是制備檢測(cè)抗體的首選抗原，對(duì)禽白血病的診斷具有重要意義。

本研究將p27 蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，蛋白表達(dá)量高并且成本低[9-10]。采用純化的原核表達(dá)蛋白作為免疫原免疫6 周齡BALB/c雌鼠，最終篩選得到一株MAb 2C7。Western blot 鑒定表明MAb 2C7 能夠識(shí)別ALV 衣殼蛋白p27。IFA試驗(yàn)表明MAb 2C7 能夠與家禽中常見(jiàn)的ALV 亞群：A、B 和J 亞群病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，這表明該MAb 與不同亞群ALV 具有良好的反應(yīng)活性，為禽白血病病原學(xué)診斷方法的建立提供了有利的工具。

P27 蛋白作為ALV 的群特異性抗原，因?yàn)槠湫蛄斜Ｊ夭⑶液性S多抗原性強(qiáng)表位而成為制備檢測(cè)抗體的首選抗原，對(duì)禽白血病的診斷具有重要意義。然而，目前對(duì)于p27 蛋白抗原表位的分析很少。確定蛋白上特異的抗原決定簇位點(diǎn)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要方法并且已經(jīng)應(yīng)用到疾病診斷和表位疫苗的研究中[11-13]。本研究通過(guò)對(duì)p27 蛋白進(jìn)行截短表達(dá)，確定了其抗原表位位于129LVAITASA LQAFRE142。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，本研究所鑒定的p27 表位在ALV 各亞群之間高度保守。因此，該表位對(duì)于ALV 群特異性抗原檢測(cè)試劑盒的研究具有重要意義。

本研究所制備的MAb 2C7 以及對(duì)p27 抗原表位的分析為ALV 感染的檢測(cè)、p27 蛋白功能研究以及研發(fā)新的禽白血病ELISA 抗原檢測(cè)試劑盒提供了有利的工具。

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