佟 杰，王 剛，于 穎,3，張 沖,2，常亞飛，劉永剛，涂亞斌，湯艷東，姜成剛，王淑杰，蔡雪輝*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

高致病性豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)是由HP-PRRS 病毒(HP-PRRSV)引起的豬病毒性傳染病。HP-PRRSV 主要感染豬單核巨噬細胞系統(tǒng)，引起仔豬的明顯發(fā)病特征為持續(xù)高熱和免疫抑制，尤其是免疫抑制的出現(xiàn)對防制該病造成了很大的阻礙[1-2]。本實驗室前期研究表明，HP-PRRSV HuN4 株感染斷奶仔豬可引起胸腺萎縮、胸腺細胞大量凋亡、外周血CD4+/CD8+顯著下調(diào)[1-3]、外周免疫器官損傷并伴有淋巴細胞凋亡[4]，同時伴有大量炎性因子(IL-lβ、IL-6 和TNF-α 等)分泌[2,5]。

糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的一類甾體激素，其通過與細胞質(zhì)內(nèi)的特異性受體結(jié)合形成復(fù)合物來發(fā)揮作用[6]。本實驗室前期研究表明，HP-PRRSV HuN4 株感染斷奶仔豬7 d 后，外周血中糖皮質(zhì)激素含量顯著升高，并且與促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 及外周血淋巴細胞凋亡具有一定相關(guān)性，但經(jīng)典病毒株感染并無類似變化(待發(fā)表資料)。

地塞米松(DEX)是一種在臨床中應(yīng)用十分廣泛的糖皮質(zhì)激素類似物，具有抑制免疫應(yīng)答、抗炎、抗過敏及抗休克等作用[6-8]，目前主要應(yīng)用于危重疾病的急救和各類炎癥的治療。本研究通過在不同時間對感染HP-PRRSV HuN4 株的斷奶仔豬肌肉注射糖皮質(zhì)激素類似物DEX，分析其對HP-PRRSV 感染仔豬的發(fā)病影響，為全面研究HP-PRRSV 的致病機理和臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實驗動物 HP-PRRSV HuN4 株由本實驗室保存，病毒滴度為1×105TCID50/mL；17 頭30 日齡的PRRSV 抗原、抗體陰性的健康斷奶仔豬購自哈爾濱周邊PRRSV 抗原抗體陰性豬場。

1.2 主要試劑 DEX 磷酸鈉注射液(5 mg/mL)購自哈藥集團制藥六廠；禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA酶抑制劑、Ex Taq DNA 聚合酶(Hot Start Version)購自TaKaRa 公司；豬白介素 1β(IL-1β)、IL-6、TNF-α ELISA kit 購自Cloud Clone-Corp(USA)公司；Anti-pig CD4-FITC antibody、Anti-pig CD8-R-PE antibody、Anti-pig CD3-SPRD antibody 購自Southern Biotech 公司。

1.3 實驗設(shè)計 17 頭30 日齡的健康斷奶仔豬隨機分為5 組，HuN4+DEX(H)組5 頭，HuN4+DEX(L)組3 頭，DEX+HuN4 組2 頭，HuN4 單獨感染組4頭，空白對照組3 頭。具體實驗設(shè)計見表1。每日觀察臨床癥狀并測量直腸溫度，并于感染后0、3 d、7 d、10 d 前腔靜脈采血。第14 d 全部迫殺。

表1 實驗分組設(shè)計Table 1 Experimental design

1.4 外周血病毒載量的檢測 將新鮮采集的抗凝血按照RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。采用熒光定量RT-PCR 方法檢測外周血中的病毒載量[9]。

1.5 血清中細胞因子蛋白含量的檢測 按照ELISA試劑盒說明書對血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 進行檢測，每個樣品重復(fù)兩孔，重復(fù)試驗兩次。

1.6 外周血淋巴細胞亞群的檢測 參考文獻[3]，采用流式細胞術(shù)檢測外周血中淋巴細胞亞群的變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢病變 HuN4+DEX(H)組、HuN4+DEX(L)組及DEX+HuN4 組均在感染后2 d開始呈現(xiàn)40 ℃以上高熱，與HuN4 組相比，體溫?zé)o顯著差異(圖1A)。HuN4+DEX(H)組、HuN4+DEX(L)組及DEX+HuN4 組在感染后14 d 內(nèi)全部死亡(圖1B)，病死豬病理變化明顯：肺臟淤血，肉樣變；胸腺嚴(yán)重萎縮，腹股溝和頜下淋巴結(jié)腫大，部分豬脾臟腫大出現(xiàn)壞死(表2)。HuN4 單獨感染組眼觀發(fā)病癥狀明顯，DEX 注射組部分實驗豬出現(xiàn)明顯的耳部發(fā)紺癥狀。

表2 實驗豬剖檢病變Table 2 Gross lesions of experimental piglets in all groups

圖1 感染后實驗豬體溫(A)和存活率(B)變化曲線Fig.1 Changes of temperature curve(A)and survival proportion of piglets(B)during HP-PRRSV infection

2.2 外周血中病毒載量 采用熒光定量RT-PCR 檢測各組實驗豬外周血中病毒載量。結(jié)果顯示，DEX+HuN4 組病毒載量在病毒感染后7 d 達到107.5拷貝/mL，10 d 達到109.5拷貝/mL。其他DEX 注射組與HuN4 單獨感染組相比無明顯變化，空白對照組未檢測到病毒(圖2)。

圖2 病毒感染后不同時間外周血病毒載量Fig.2 Viral RNA loads in peripheral blood of piglets

2.3 外周血中促炎性細胞因子變化 采用ELISA法對外周血中促炎性細胞因子進行檢測，結(jié)果顯示，于感染后3 d，HuN4 單獨感染組外周血中主要的促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白含量開始上升，7 d 明顯升高。DEX 注射組與空白對照組相比，各炎性因子的蛋白水平均有一定程度上升，但均低于HuN4 單獨感染組(圖3)。該結(jié)果表明DEX 對HP-PRRSV 引起的炎性反應(yīng)起到了一定的抑制的作用。

2.4 外周血中淋巴細胞亞群變化 采用流式細胞術(shù)對外周血中淋巴細胞亞群進行檢測，結(jié)果顯示，于感染后7 d，HuN4 單獨感染組豬外周血中的CD4+CD8-細胞比例顯著減少，由19.8%減少到6.1%(p<0.05)(圖4A)，而CD4-CD8+細胞比例顯著增加，由27.6%增加到69.2 %(p<0.05)(圖4B)，CD4+CD8+細胞比例先減少后增加(圖4C)。DEX 注射組與HuN4 單獨感染組變化趨勢相似，但均有所緩和。

圖3 外周血中促炎性細胞因子水平變化(a,b：不同字母表示差異顯著，p<0.05)Fig.3 Concentration of pro-inflammatory cytokines in peripheral blood(a,b:values with different letters were significantly different,p<0.05)

圖4 外周血內(nèi)淋巴細胞亞群比例(a,b：不同字母表示差異顯著，p<0.05)Fig.4 Proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood(a,b:values with different letters were significantly different,p<0.05)

3 討論

HP-PRRSV 感染會引起仔豬體溫高熱、胸腺萎縮及淋巴細胞發(fā)生大量凋亡[10]。病毒感染與機體的相互作用十分復(fù)雜，通常是以免疫系統(tǒng)為主，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)輔助參與調(diào)節(jié)的過程。神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫環(huán)路中，最重要的中心環(huán)節(jié)即為下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)(HPA 軸)[11-12]，其主要的調(diào)控機制是通過控制以糖皮質(zhì)激素為主的一系列內(nèi)分泌激素的釋放影響細胞內(nèi)靶基因，如促炎性細胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的轉(zhuǎn)錄以及NF-kB、MAPK 等信號通路的激活，從而達到參與調(diào)節(jié)機體在病原微生物感染后的免疫功能[12]。

糖皮質(zhì)激素具有一定的免疫抑制作用，可以起到退熱消炎的效果，但有報道表明，在流感病毒感染的小鼠中，過量的糖皮質(zhì)激素雖然可以部分緩解炎癥反應(yīng)，但卻使病毒的復(fù)制增強，從而加重了病毒載量升高引起的病理損傷[13]。在本實驗中，通過采用不同劑量的糖皮質(zhì)激素類似物DEX，觀察其對HP-PRRSV 感染后的仔豬臨床發(fā)病癥狀和免疫系統(tǒng)淋巴細胞亞群的影響。結(jié)果表明，連續(xù)7 d 使用低劑量糖皮質(zhì)激素，造成了感染仔豬機體內(nèi)3 種主要的促炎性細胞因子水平下降，加強了病毒的復(fù)制，從而使病毒感染造成的損傷加重，造成仔豬死亡。但促炎性細胞因子引起病毒復(fù)制增強的具體機制仍有待于進一步研究。另外本實驗對臨床用藥也具有一定的指導(dǎo)意義，作為臨床中的常用藥，DEX 的使用具有嚴(yán)格限制。本實驗中連續(xù)7 d 低劑量注射DEX 會造成仔豬機體免疫抑制，增加其死亡率，因此證實不當(dāng)使用激素類藥物會造成病毒感染加重。目前，一些飼料添加劑中由于含有糖皮質(zhì)激素，而引起動物感染病毒后病情加重的現(xiàn)象可能也與這一機制有關(guān)。

[1]Wang Gang,Yu Ying,Liu Yong-gang,et al.Immune responses in piglets infected with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Immunol Immunopathol,2011,142(3-4):170-178.

[2]Han Zi-feng,Liu Yong-gang,Wang Gang,et al.Comparative analysis of immune responses in pigs to high and low pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated in China[J].Transbound Emerg Dis,2013.

[3]He Yu-li,Wang Gang,Liu Yong-gang,et al.Characterization of thymus atrophy in piglets infected with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Microbiol,2012,160(3-4):455-462.

[4]Wang Gang,He Yu-li,Tu Ya-bin,et al.Comparative analysis of apoptotic changes in peripheral immune organs and lungs following experimental infection of piglets with highly pathogenic and classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virol J,2014,11:2.

[5]Liu Yong-gang,Shi Wen-da,Zhou En-min,et al.Dynamic changes in inflammatory cytokines in pigs infected with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Clin Vaccine Immunol,2010,17(9):1439-1445.

[6]Matasic R,Dietz A B,Vuk-Pavlovic S.Dexamethasone inhibits dendritic cell maturation by redirecting differentiation of a subset of cells[J].J Leukoc Biol,1999,66(6):909-914.

[7]Riccardi C,Cifone M G,Migliorati G.Glucocorticoid hormone-induced modulation of gene expression and regulation of T-cell death:role of GITR and GILZ,two dexamethasoneinduced genes[J].Cell Death Differ,1999,6(12):1182-1189.

[8]Anderson B H,Watson D L,Colditz I G,et al.The effect of dexamethasone on some immunological parameters in cattle[J].Vet Res Commun,1999,23(7):399-413.

[9]韋天超，田志軍，安同慶，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒Taq Man-MGB 熒光定量RT-PCR 方法的建立和應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，(12)：944-948.

[10]何玉利，劉永剛，王剛，等.不同毒力豬繁殖與呼吸綜合征病毒對仔豬肺和外周免疫器官損傷的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，(1)：6-10.

[11]Kanczkowski W,Sue M,Zacharowski K,et al.The role of adrenal gland microenvironment in the HPA axis function and dysfunction during sepsis[J].Mol Cell Endocrinol,2015,408:241-248.

[12]Nicolaides N C,Kyratzi E,Lamprokostopoulou A,et al.Stress,the stress system and the role of glucocorticoids[J].Neuroimmunomodulation,2015,22(1-2):6-19.

[13]Ruzek M C,Pearce B D,Miller A H,et al.Endogenous glucocorticoids protect against cytokine-mediated lethality during viral infection[J].J Immunol,1999,162(6):3527-3533.