馮麗蘋，張洪亮，劉春曉，冷超糧，陳家锃，李 真，彭金美，王 倩，白 云，張武超，安同慶，蔡雪輝，童光志，田志軍

(1.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；2.南陽師范學院，河南南陽 473061；3.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，為單鏈RNA 病毒，基因組全長約為12.3 kb。目前，CSFV 被分為3 個基因型(1、2 和3 基因型)10 個亞型(1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3、3.4)[1]，2.1 亞型被進一步分為2.1a 和2.1b[2]，近幾年還出現(xiàn)了2.1c 亞型[3]和1.4 亞型[4]。我國存在4 個亞型(1.1、2.1、2.2和2.3)，上世紀九十年代后2.1b 亞型CSFV 在我國占主導地位。CSF 為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的一個重要疫病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須上報的動物傳染病之一[5]。

我國對CSF 的防控主要采取兔化弱毒疫苗(C株)強制免疫進行該病的防控，并取得了良好的效果，C 株疫苗免疫原性好，對我國2.1b 基因亞型病毒株也具有良好的交叉保護效果[2-3]。但2014 年在我國部分豬場出現(xiàn)了2.1d 新基因亞型的CSFV[6]，為了進一步了解2.1d 亞型CSFV 在我國的流行現(xiàn)狀，本研究對2015 年在我國部分地區(qū)檢測到的CSFV 進行分子流行病學分析，為CSF 的有效防控提供了流行病學數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣品采集及處理 在4 個省份(山東、吉林、黑龍江、河北)的疑似感染CSFV 的豬場采集病豬肺、脾、腎、血清共28 份樣品。將組織研磨均勻，取一部分用于提取RNA，其余的病料樣品置于-80 ℃保存，用于后續(xù)研究分析。

1.2 主要試劑 RNA 提取試劑盒RNeasy plus Mini Kit 購于Qiagen 公司；AMV 反轉錄酶、LA Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和pMD18-T 載體等購自TaKaRa公司。

1.3 E2 基因的擴增及測序 利用RNA 提取試劑盒提取組織勻漿和血清中的總RNA。經反轉錄制備cDNA。根據(jù)已發(fā)表的CSFV zj0801(FJ529205)的E2基因序列設計擴增引物(5'-GTAAATATGTGTGTGTT AGACCAGA-3'/5'-GTGTGGGTAATTGAGTTCCCTAT CA-3')。PCR 反應程序為，94 ℃5 min；94 ℃30 s、54.8 ℃30 s、72 ℃1.5 min，共35 個循環(huán)；72 ℃10 min。對PCR 產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將目的片段用Gel Extraction Kit(OMEGA,USA)回收。純化的PCR 產物克隆到pMD18-T 載體中。重組克隆由庫美生物進行測序。

1.4 遺傳進化分析 將陽性樣品的E2 基因全長序列進行測序，利用MEGA5.1 的Neighbor-joining method 進行進化樹分析。將樣品序列結果與171 株參考株的E2 全長(1 119 bp)進行遺傳進化分析。

1.5 E2 基因和推導氨基酸分析 利用DNAstar 軟件將陽性樣品的E2 基因的核苷酸和氨基酸序列與shimen、HCLV、2.1b 國內流行株及2.1d 自身進行比對。

2 結果

2.1 CSFV 檢測結果 2014 年8 月起，一些經CSF兔化弱毒疫苗免疫的豬場出現(xiàn)疑似CSF，表現(xiàn)為發(fā)熱、厭食、體重減輕、皮膚黃萎病等，死亡率為5 %～50 %。表1 為我們2014 年～2015 年檢測到的CSFV 陽性樣品信息，其中2015 年在4 個省檢測到14 份陽性樣品。

2.2 遺傳進化樹分析 進化樹分析選取了119 個E2 全序列，134 個E2 部分序列[6]。CSFV 分為3 個基因型(1、2 和3)，基因型2 進一步分為2.1 亞型、2.2 亞型和2.3 亞型。2.1 亞型包括2.1a、2.1b、2.1c和2.1d(圖1)。2015 年檢測到的14 個CSFV 病毒株有11 株(SDQZ150414、SDZC150416、SDQZ150319、SDLK150320、HLJSH150609、SDZC150514、SDZC 150601、HB150528、HB150309、JL150418、NK 150425)屬于2.1d 新亞型。其余的3 個病毒株(SDZC150526、SDHS10150129、SDHS9150129)屬于2.1b 亞型。E2 全序列與E2 部分序列的遺傳進化樹分析都顯示相同的結果。

表1 2014 年～2015 年CSFV 陽性樣品信息Table 1 Information of CSFVs isolated during 2014-2015

2.3 E2 的核苷酸和氨基酸序列分析 2015 年14個新分離病毒株的E2 基因全長有1119 個核苷酸，編碼373 個氨基酸。14 個病毒株中11 個屬于2.1d新基因亞型，它們與CSFV 代表株Shimen、HCLV和2.1b 基因亞型毒株的核苷酸同源性分別為82.8 %～84.1 %、81.1 %～82.4 %和92.6 %～97.1 %，氨基酸同源性分別為89.8 %～91.2 %、88.2 %～89.8 %和94.1 %～98.9%(表2)，其余3 個病毒株屬于2.1b亞型。這些2.1d 亞型新分離株在E2 基因R31、S34、K303和A3314 個氨基酸上具有相同的分子特征(圖2)。

3 討論

CSF 是一種高度接觸性、急性傳染病，以高發(fā)病率、高死亡率、全身各臟器出血、高熱稽留為主要特征，曾對我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失。自從上個世紀五十年代豬瘟兔化弱毒疫苗在我國的廣泛應用，CSF 對我國養(yǎng)豬業(yè)的危害已顯著降低[7-8]，但CSF 在我國并沒有根除，并隨著時間不斷演變，流行株從1.1 亞型為主逐漸演化到2.1 亞型為主[8-10]。近些年盡管分離到了野毒株，然而分離到的病毒株數(shù)量少，分子特征不明顯，而且可能需要一年甚至幾年的時間[11-12]。測序和遺傳進化分析是了解CSFV流行的重要工具之一，同時也為CSF 的防控提供了分子流行病學的數(shù)據(jù)。目前，用于CSFV 分型的基因區(qū)域主要有5'NTR、E2、NS5B，應用最廣泛的是E2 和NS5B 基因區(qū)。基于E2 和NS5B 基因，Lowings 等將1945～1994 年間14 個國家的CSFV 分成了2 個基因型和5 個基因亞型[13]。目前，CSFV 分為3 個基因型和10 個基因亞型，2.1 亞型進一步分為2 個基因亞型(2.1a 和2.1b)，隨后Postel 等報道了1.4 亞型[4]。近年來，我國主要流行2.1b 亞型，Jiang 等首次報道了我國2.1c 亞型的出現(xiàn)。2014 年我國一些豬場出現(xiàn)疑似CSF 癥狀，造成不同程度的損失[6]，檢測證實這些疫情是由CSFV 引起，通過序列比對和遺傳進化分析(基于E2 全長和E2 部分序列)，結果表明檢測到的CSFV 和2014 年的一些病毒株形成一個新2.1d 基因亞型，2.1d 亞型病毒株間具有相同的分子特征[6]。

表2 2.1d 新亞型的E2 基因與CSFV 參考株同源性比對結果Table 2 The nucleotides and amino acids of E2 gene between 2.1d new subgenotype and shimen,HCLV,2.1b subgenotype and themselves

為進一步了解2.1d 亞型CSFV 在我國的流行現(xiàn)狀，本研究中，我們對2015 年在我國部分地區(qū)檢測到的CSFV 進行分子流行病學分析，研究結果與我們2014 年CSFV 流行病學研究結果一致，表明2.1d亞型病毒株已成為我國現(xiàn)階段CSFV 的主要流行株。由于在不到一年內僅我們實驗室就在我國5 個省20多個豬場檢測到2.1d 亞型毒株，因此該病毒株可能在我國已廣泛出現(xiàn)，但2.1d 亞型病毒株在我國的具體流行狀況和危害程度還需要進一步驗證，并盡快開展有關2.1d 亞型病毒株的致病性及現(xiàn)有疫苗對其保護效果的研究，更有效地控制CSFV 的流行。

圖1 2014～2015 年32 株新分離CSFV 與參考病毒株的遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 32 new isolates of CSFVs and reference strains

圖2 32 株新分離毒株和19 株參考毒株的E2 基因的氨基酸比對結果Fig.2 Alignments of 32 new isolates and other 19 reference CSFVs based on E2 amino acid sequence

[1]Paton a D J,McGoldricka A,Greiser-Wilkeb I,et al.Genetic typing of classical swine fever virus[J].Vet Microbiol,2000,73:137-157.

[2]Pan C H,Jong M H,Huang T S,et al.Phylogenetic analysis of classical swine fever virus in Taiwan[J].Arch Virol,2005,150:1101-1119.

[3]Jiang Da-liang,Gong Wen-jie,Li Run-cheng,et al.Phylogenetic analysis using E2 gene of classical swine fever virus reveals a new subgenotype in China[J].Infect Genetics Evol,2013,17:231-238.

[4]Postel A,Schmeiser S,Perera C L,et al.Classical swine fever virus isolates from Cuba form a new subgenotype 1.4[J].Vet Microbiol,2013,161(3-4):334-8.

[5]Edwards S,Fukusho Akio,Lefèvrec P C,et al.Classical swine fever:the globai situation[J].Vet Microbiol,2000,73(2):103-119.

[6]Zhang Hong-liang,Leng Chao-liang,Feng Li-ping,et al.A new subgenotype 2.1d isolates of classical swine fever virus in China,2014[J].Infect Genet Evol,2015,34:94-105.

[7]仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗-半個世紀的回顧[J].中國農業(yè)科學，2005，8(8)：1675-1685.

[8]Luo Yu-zi,Li Su,Sun Yuan,et al.Classical swine fever in China[J].Vet Microbiol,2014,172:1-6.

[9]Tu Chang-chun,Lu Zong-ji,Li Hong-wei,et al.Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China[J].Virus Res,2001,81:29-37.

[10]呂宗吉，涂長春，余興龍，等.我國豬瘟的流行病學現(xiàn)狀分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2001，23：300-303.

[11]彭志成，龔文杰，呂宗吉,等.廣東省豬瘟病毒流行毒株遺傳多樣性分析[J].中國獸醫(yī)學報，2014，6，34：894-903.

[12]Luo Ting-rong,Liao Su-huan,Wu Xian-shi,et al.Phylogenetic analysis of the E2 gene of classical swine fever virus from the Guangxi Province of southern China[J].Virus Genes,2011,42:347-354.

[13]Paul L,Georgina I,Jennifer N,et al.Classical swine fever virus diversity and evolution[J].J Gen Virol,1996,77(6):1311-1321.