王錦祥，程曉霞，陳少鶯*，陳仕龍，林鋒強，王 劭

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

鴨出血性壞死性肝炎是由新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)引起鴨的一種新發(fā)傳染病，其特征是肝臟不規(guī)則壞死和出血、心肌出血、脾臟腫大斑塊狀壞死、腎臟和法氏囊出血。NDRV主要感染雛鴨，感染鴨死亡率高，日齡愈小并發(fā)感染時其發(fā)病率、死亡率愈高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。自陳少鶯等首次將鴨出血性壞死性肝炎的病原鑒定為NDRV 后[1]，在我國福建[2]、廣東[3]和浙江[4]等地的鴨群中相繼有該病發(fā)生的報道，疫區(qū)有逐年擴大的趨勢。

目前，已報道的NDRV 實驗室檢測方法尚未見ELISA 方法報道。ELISA 是一種簡便、快速、敏感且適用于大批量樣品檢測的血清學(xué)方法[5]。本研究以原核表達(dá)的NDRV 外衣殼蛋白σC 為檢測抗原，建立了檢測NDRV 抗體的間接ELISA 方法，為NDRV 抗體檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清和臨床樣品 重組菌pET-NDRVσC/BL21 由本實驗室構(gòu)建并保存；NDRV 陽性和陰性血清、番鴨呼腸孤病毒(MDRV)、鴨肝炎病毒(DHV)、番鴨細(xì)小病毒(MPV)和番鴨源鵝細(xì)小病毒(MD-GPV)陽性血清均由本實驗室保存；NDRV 陰性血清為采自浙江、福建和廣東等地區(qū)經(jīng)NDRV 全病毒間接ELISA 檢測為陰性的鴨血清；待檢血清樣品采自浙江、福建、廣東等不同地區(qū)的212 份疑似NDRV 感染鴨。

1.2 主要試劑 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG(IgG-HRP)購自美國KPL 公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鎳離子親和純化柱購自GE 公司。

1.3 重組蛋白的表達(dá)及純化 將重組菌pETNDRV-σC/BL21 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，按照His Trap FF 蛋白純化步驟純化σC 重組蛋白，通過SDS-PAGE 及western blot 對重組蛋白進(jìn)行鑒定。

1.4 間接ELISA 方法的建立 將重組蛋白經(jīng)pH9.6的碳酸鹽緩沖液倍比稀釋(50 μg/mL～3.12 μg/mL)后包被96 孔ELISA 板，每孔100 μL，4 ℃過夜。以NDRV 陽性血清和陰性血清(1∶20～1∶320)倍比稀釋后為一抗，每孔100 μL，37 ℃作用90 min。以羊抗鴨IgG-HRP(1∶400)為二抗，37 ℃作用60 min。加入底物，37 ℃作用3 min～15 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定樣品的OD490nm值。上述操作重復(fù)3次。以陽性血清OD490nm值大于1.0，P/N 值(陽性血清OD490nm/陰性血清OD490nm)最大時的反應(yīng)條件為最佳工作條件。

1.5 間接ELISA 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 參照文獻(xiàn)[6]的方法，將164 份NDRV 陰性血清在最佳工作條件下進(jìn)行間接ELISA 測定。計算每份血清的S/P 值及平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)確定陰陽性臨界值S/P=(樣品OD490nm值-陰性對照OD490nm值)/(陽性對照OD490nm值-陰性對照OD490nm值)

1.6 阻斷試驗 將陽性血清按最佳稀釋度進(jìn)行稀釋，加入等體積最適稀釋度的重組抗原，于37 ℃作用1 h，將上述混合液加入已包被抗原的酶標(biāo)板，同時設(shè)陽、陰性血清對照組，進(jìn)行ELISA 反應(yīng)，測定其OD490nm。按(N-P)/N=(未阻斷孔OD490nm值-阻斷孔OD490nm值)/(未阻斷孔OD490nm值)的公式計算，若結(jié)果大于0.5，則判斷為阻斷陽性。

1.7 特異性試驗 按照建立的ELISA 方法，對本實驗室保存的MDRV、DHV、MPV 和MD-GPV 的陽性血清進(jìn)行檢測，每份血清設(shè)3 個重復(fù)，同時設(shè)置NDRV 陽性和陰性血清對照，驗證建立的ELISA方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗 采用同一時間和不同時間包被的ELISA 反應(yīng)板，選取NDRV 抗體效價不同的8 份血清，按建立的間接ELISA 方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。每份血清重復(fù)檢測3 次，評價該方法的重復(fù)性。

1.9 符合性試驗 應(yīng)用NDRV 全病毒間接ELISA和建立的σC 蛋白間接ELISA 方法對80 份疑似鴨血清樣品進(jìn)行檢測，統(tǒng)計兩者的符合率。

1.10 臨床血清樣品的檢測 應(yīng)用建立的σC 蛋白間接ELISA 方法，檢測來自浙江、福建和廣東等不同地區(qū)共132 份疑似NDRV 感染的血清樣品，計算樣品的陽性率。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白的表達(dá)及鑒定 重組菌pET-NDRVσC/BL21 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后對重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示重組蛋白獲得表達(dá)，其分子量約為40 ku，與預(yù)期結(jié)果相符，并且重組蛋白以包涵體形式存在。Western blot 結(jié)果表明，重組蛋白與NDRV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性(圖1)。

圖1 NDRV σC 純化蛋白的SDS-PAGE 和western blot 分析Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of the purified NDRV σC protein

2.2 間接ELISA 反應(yīng)條件的確定 對間接ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。

表1 間接ELISA 檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

2.3 間接ELISA 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 應(yīng)用優(yōu)化的間接ELISA 方法，對164 份NDRV 陰性血清樣品進(jìn)行檢測，經(jīng)計算為0.0564，SD 為0.0381。確定臨界值為0.171，即OD490nm大于(等于)0.171判定為陽性，小于0.171 則判定為陰性(圖2)。

圖2 陰性血清S/P 值分布圖Fig.2 Frequency distribution of S/P value of negative serum

2.4 阻斷試驗 將陽性血清與重組抗原等體積混合后加入已包被抗原的ELISA 板進(jìn)行阻斷試驗，結(jié)果顯示，經(jīng)重組蛋白阻斷的陽性血清OD490nm值比未被阻斷的對照陽性血清明顯降低，阻斷后OD490nm值平均為0.338，對照陽性血清的OD490nm值平均為1.560，計算阻斷率為0.783，大于0.5，判定為阻斷試驗陽性，表明重組抗原可以阻斷陽性血清與重組蛋白的反應(yīng)。

2.5 特異性試驗 對MDRV、DHV、MPV 和MDGPV 4 份陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明重組蛋白與這4 種鴨病原的陽性血清均無交叉反應(yīng)，表明該檢測方法具有較好的特異性。

2.6 重復(fù)性試驗 采用同一時間和不同時間包被的ELISA 板，對NDRV 抗體效價不同的8 份血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于5%，表明該方法具有良好的重復(fù)性(表2)。

表2 間接ELISA 重復(fù)性試驗Table 2 Repeatability assay for indirect ELISA

2.7 符合性試驗 應(yīng)用NDRV 全病毒間接ELISA和建立的σC 蛋白間接ELISA 方法對80 份疑似鴨血清樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示NDRV 全病毒間接ELISA 的陽性檢出率為41.25 %(33/80)，陰性檢出率為58.75 %(47/80)。本研究建立的σC 蛋白間接ELISA 方法陽性檢出率為35 %(28/80)，兩者符合率為88.75 %(表3)。

表3 σC 蛋白間接ELISA 和NDRV 全病毒間接ELISA方法的符合性試驗Table 3 Comparison of the agreement between σC-ELISA and NDRV-ELISA

2.8 臨床樣品的檢測 應(yīng)用建立的σC 蛋白間接ELISA 方法對浙江、福建、廣東等不同地區(qū)的132份疑似感染鴨血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示檢出陽性樣品57 份，陽性率為43.18 %(57/132)。

3 討論

σC 蛋白是禽源呼腸孤病毒(ARV)的重要結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒感染過程中，σC 蛋白被活化，形成同源三聚體，與易感細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促使病毒侵入易感細(xì)胞，是病毒的重要致病因子。此外，σC蛋白還能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[7-9]。研究表明，桿狀病毒表達(dá)的ARV[10]和MDRV[11]的σC 蛋白能夠有效地誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生保護(hù)性抗體，表明σC 蛋白是一種保護(hù)性抗原。耿宏偉等利用E.coli 系統(tǒng)表達(dá)出具有良好反應(yīng)原性的MDRV σC 蛋白，并基于該蛋白建立了間接ELISA 方法[12]。本實驗也選擇E.coli 系統(tǒng)表達(dá)NDRV σC 蛋白。經(jīng)western blot鑒定表明，重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。因此，選擇E.coli 表達(dá)的σC 蛋白作為抗原能夠滿足建立檢測NDRV 抗體間接ELISA 方法的要求。

目前，國內(nèi)外尚未見利用NDRV 重組σC 蛋白作為包被抗原建立間接ELISA 方法的報道。本實驗利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了NDRV σC 蛋白，并采用純化的蛋白作為包被抗原，建立了檢測NDRV 抗體的間接ELISA 方法，并對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。同時試驗表明其具有良好的特異性和重復(fù)性。通過對浙江、福建和廣東3 省采集的132 份疑似血清樣品進(jìn)行檢測陽性率為43.18 %。因此，采用該方法用于檢測大批量血清樣品具有較高的應(yīng)用價值，可以廣泛應(yīng)用于σC 蛋白抗體的流行病學(xué)調(diào)查，同時也為研制檢測NDRV 抗體的間接ELISA 試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

[1]陳少鶯，陳仕龍，林鋒強，等.一種新的鴨病(暫名鴨出血性壞死性肝炎)病原學(xué)研究初報[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25(16)：28-31.

[2]陳少鶯，陳仕龍，林鋒強，等.新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].病毒學(xué)報，2012，28(3)：224-230.

[3]袁遠(yuǎn)華，吳志新，黃興國，等.新型鴨呼腸孤病毒病研究進(jìn)展[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2012，10：18-20.

[4]Wang Dan,Xu Feng,Ma Guo-ming,et al.Complete genomic sequence of a new Muscovy duck-origin reovirus from China[J].J Virol,2012,86(22):12445.

[5]范祚舟，徐加發(fā)，沈萍萍.酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，27(1)：113-118.

[6]董井泉，張蕾，馬波，等.1 型鴨肝炎病毒VP1 蛋白優(yōu)勢抗原區(qū)的鑒定及抗體檢測ELISA 方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2014，36(7)：542-546.

[7]馬輝，趙緒永.ELISA 技術(shù)在畜牧行業(yè)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報，2010，30(2):13-15.

[8]Weiner H L,Fields B N.Neutralization of reovirus:the gene responsible for the neutralization antigen[J].J Exp Med,1977,146:1305-1310.

[9]Gouvea V S,Schnitzer T J.Polymorphism of the migration of double-stranded RNA genome segments of avian reoviruses[J].J Virol,1982,43:465-471.

[10]Wickramasinghe R,Meanger J,Enriquez C E,et al.Avian reovirus proteins associated with neutralization of virus infectivity[J].Virology,1993,194:688-696.

[11]Kuntz S G,Blanchard P,Cherbonnel M,et al.Baculovirusexpressed muscovy duck reovirus sigma C protein induces serum neutralizing antibodies and protection against challenge[J].Vaccine,2002,(20):3113-3122.

[12]耿宏偉，郭東春，張云，等.以番鴨呼腸孤病毒σC 表達(dá)蛋白為抗原的ELISA 檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36(3)：171-176.