龍 毅，楊武德，袁吉虎（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院化學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550002）

石韋為蕨類植物水龍骨科植物石韋Pyrrosia lingua（Thunb.）Farwell的全草，別名有柄石韋、刀尖藥、石茶葉；主治利尿通淋：用于泌尿系威染、小便不利、淋瀝澀痛等（治泌尿系結(jié)石）；清熱止血：用于熱證吐血、血崩等；此外，石韋水煎劑還有一定的抗過敏作用，還可升高因化療及放療引起的白細(xì)胞減少[1]。石韋是貴州各民族的常用藥。目前，市面上有治療結(jié)石的復(fù)方石韋片等多種制劑，市場(chǎng)效益顯著。石韋所含的氨基酸具有調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能、增強(qiáng)免疫力的功效[2-3]。本研究以異硫氰酸苯酯（PITC）為衍生試劑[4-5]，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)對(duì)石韋中4 種氨基酸進(jìn)行分析[6-7]。

1 材料

LC-20AT 型HPLC 儀，包括SPD-20A 檢測(cè)器、二元高壓梯度泵、CTO-20A 柱溫箱、LC Solution Lite 化學(xué)工作站（日本島津公司）；JT-5003型千分之一電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；HS10260D型超聲波清洗儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；SHZ-95 型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；YHG-600-BS-Ⅱ型遠(yuǎn)紅外快速干燥箱（上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）。

亮氨酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：876-200204，純度：99%）；谷氨酸對(duì)照品（批號(hào)：120515，純度≥99%）、甘氨酸對(duì)照品（批號(hào)：120529，純度≥99%）、丙氨酸對(duì)照品（批號(hào)：120329，純度≥99%）均由成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司提供；乙腈為色譜純，醋酸鈉、三乙胺、苯酚、濃鹽酸均為分析純，水為純凈水。

試驗(yàn)藥材于2011 年6 月采自貴州凱里市雷山縣，由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文副教授鑒定為石韋屬水龍骨科蕨類植物石韋P.lingua（Thunb.）Farwell 的全草。植物標(biāo)本存放于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院中藥研究所植物化學(xué)教研室（標(biāo)本憑證：GY20110620）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.1 mol/L 的醋酸鈉緩沖液（以醋酸鈉調(diào)節(jié)pH 至6.5）-乙腈（93∶7，V/V），流動(dòng)相B：乙腈-水（4∶1，V/V），采用梯度洗脫（0～20 min，100%→96%A；20～40 min，80%→78%A；40～45 min，70%→0A；45～55 min，0A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：300 ℃；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：5 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 稱取研勻后的樣品粉末0.6 g，精密稱定，置于安瓿瓶中，加入水解液（含0.5%苯酚的50%鹽酸溶液）10 ml，熔封安瓿，用紗布包裹，于150 ℃水解1 h，放冷，濾過，用水清洗濾渣，合并濾液和洗液于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1 mol/L鹽酸溶液15 ml分3次溶解洗滌，并轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液[8]及1 mol/L三乙胺-乙腈溶液各2.5 ml，混勻，室溫放置1 h，加50%乙腈至刻度；精密量取10 ml，加正己烷15 ml，放置20 min，取下層溶液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 取4 種氨基酸對(duì)照品適量，精密稱定，分別加入0.1 mol/L 鹽酸溶液制成每1 ml 分別含谷氨酸0.123 mg、甘氨酸0.079 2 mg、丙氨酸0.065 mg、亮氨酸0.072 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備液。取上述對(duì)照品貯備液5 ml，置于25 ml量瓶中，加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液及1 mol/L三乙胺-乙腈溶液至刻度，混勻；精密量取10 ml，加正己烷15 ml，放置20 min，取下層溶液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.2.3 陰性空白溶液 取空白安瓿瓶，自“2.2.1”項(xiàng)下“加入水解液（含0.5%苯酚的50%鹽酸溶液）10 ml”起操作制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密稱取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、對(duì)照品加供試品溶液、陰性空白溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，樣品中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸的理論板數(shù)分別為5 760.1、6 542.1、3 421.3、4 250.6，分離度分別為2.3、2.0、1.5、1.6，分離度符合要求。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.供試品加對(duì)照品；D.陰性空白；1.谷氨酸；2.甘氨酸；3.丙氨酸；4.亮氨酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substances；B.test samples；C.reference substance and test samples；D.negative blank solution；1.glutamate；2.glycine；3.alanine；4.leucine

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液1、2、3、5、10 ml，分別置于25 ml 量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法自“置25 ml 量瓶中，加入0.1 mol/L PITC-乙腈溶液”起操作，得系列濃度溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸的回歸方程分別為y＝1.6×107x－21 487（r＝0.999 1）、y＝4.3×107x－35 870（r＝0.999 9）、y＝2.8×107x－23 652（r＝0.999 4）、y＝3.8×107x+6 646.9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸的質(zhì)量濃度分別在4.92～49.2、3.168～31.68、2.6～26、2.88～28.8 μg/ml范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸峰面積的RSD分別為1.9%、1.8%、1.6%、1.6%（n＝6），表明儀器精密度良好[9]。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于放置0、4、6、8、12、24 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸峰面積的RSD分別為1.4%、2.1%、1.9%、2.2%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品6 份，每份約0.6 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果，谷氨酸平均含量為1.19 mg/g（RSD＝2.2%，n＝6）；甘氨酸平均含量0.699 mg/g（RSD＝1.7%，n＝6）；丙氨酸平均含量為0.359 mg/g（RSD＝1.9%，n＝6），亮氨酸平均含量為0.344 mg/g（RSD＝2.1%，n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品9 份，每份約0.3 g，分別置于5 ml 安瓿中，精密加入對(duì)照品溶液（0.123 mg/ml 的谷氨酸2.89 ml，0.079 2 mg/ml 的甘氨酸2.65 ml，0.065 mg/ml 的丙氨酸1.66 ml，0.072 mg/ml 的亮氨酸1.43 ml），加入1%苯酚鹽酸溶液適量，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下自“熔封安瓿，用紗布包裹，于150 ℃水解1 h”起操作，制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取樣品粉末0.6 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝6）

3 討論

3.1 氨基酸的柱前衍生化RP-HPLC法注意事項(xiàng)

本試驗(yàn)在制備供試品溶液時(shí)，最重要的就是衍生化反應(yīng)要完全，衍生化程度能決定氨基酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)采用茚三酮與氨基酸生成紫色化合物或黃色化合物計(jì)算所需衍生劑的量。試驗(yàn)所需的衍生化試劑PITC有一定毒性，保存時(shí)須防止與水接觸，以保持良好活性。氨基酸為兩性物質(zhì)，pH對(duì)其分離度影響較大，因此要保證流動(dòng)相pH的準(zhǔn)確與穩(wěn)定。

3.2 柱前衍生化原理

本試驗(yàn)所選用的PITC 可與一、二級(jí)氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC），該衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，對(duì)測(cè)定無干擾。衍生化試劑、反應(yīng)條件和反應(yīng)時(shí)間的選擇不受色譜系統(tǒng)的限制。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于石韋中4種氨基酸的含量測(cè)定。

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