何 文，胡翠蘋，瞿 振（1.武漢大學人民醫(yī)院藥學部，武漢 40060；2.武漢大學藥學院，武漢 40064；.武漢大學基礎醫(yī)學院，武漢 40064）

水飛薊賓（SLB）是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取所得的一種黃酮化合物，具有明顯的保護和穩(wěn)定肝細胞、改善肝功能的作用[1]。其藥理作用包括抗肝纖維化、抗脂質過氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)和降血脂等[2]，被廣泛應用于治療各種肝功能紊亂疾病，如肝硬化、肝炎、脂肪肝等[3]。SLB是一種脂溶性的物質，口服生物利用度低[4]，嚴重影響了其藥效的發(fā)揮。脂質體作為一類新型藥物載體，能實現(xiàn)靶向和緩釋給藥，提高難溶性藥物的生物利用度，降低藥物毒副作用。N-三甲基殼聚糖（TMC）是殼聚糖的水溶性衍生物，帶正電，因其良好的組織相容性和生物可降解性，被廣泛用作納米粒的載體材料[5]；同時，帶正電荷的高分子載體藥物進入體內后，可很快被體內的網狀內皮系統(tǒng)吞噬，易于聚集在肝臟[6]。為了提高SLB 的肝靶向性，本研究擬采用季銨化程度約為60%的TMC（簡稱TMC60）包覆SLB 脂質體（SLBL），形成陽離子脂質體（TMC60-SLBL），并對其處方及制備工藝進行優(yōu)化，以期為SLB肝靶向制劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

SPD-20A、LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Zetasizer 3000HS 型激光粒度分析儀（英國馬爾文公司）；H-1600RW型高速冷凍離心機（武漢世紀超杰實驗儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

SLB 原料藥（西安飛達生物技術有限公司，批號：FD20140117，純度：98%）；SLB 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110856-201305，純度：≥98%）；TMC60（武漢大學人民醫(yī)院藥劑學實驗室自制，批號：20130530，季銨化程度：64.4%）；卵磷脂（批號：20130724）和膽固醇（批號：20120627）均購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇為色譜純，氯仿、乙醇等試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 SLB的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[7]色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（54∶46∶0.5），流速：0.8 ml/min；檢測波長：288 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μl。分別取適量SLB對照品、TMC60-SLBL、空白TMC60 脂質體樣品，經0.45 μm 的微孔濾膜過濾后，進樣分析。結果表明，在此條件下，輔料對SLB測定無干擾。

2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取在真空干燥箱60 ℃干燥至恒質量的SLB對照品10 mg，置于50 ml量瓶中，加適量甲醇溶解，并用流動相定容，搖勻，制備成200 μg/ml的貯備液。分別精密量取貯備液0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 ml，置于10 ml量瓶中，用流動相定容，搖勻，稀釋得到質量濃度為2、5、10、20、40、80 μg/ml 的對照品溶液。用0.45 μm微孔濾膜濾過后，進樣測定。以峰面積（y）對質量濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程為y＝69 379x+21 315（r＝0.999 9）。結果表明，SLB 檢測質量濃度的線性范圍為2～80 μg/ml。

2.1.3 回收率試驗 取空白TMC60脂質體2 ml，置于10 ml量瓶中，精密吸取不同量的SLB貯備液，制備成5、20、60 μg/ml的樣品，再用適量甲醇破乳，并加流動相定容搖勻，以離心半徑2.5 cm（下同）、12 000 r/min 離心10 min，取上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾后，進樣測定，計算回收率。結果，平均回收率分別為（99.33±1.00）%、（99.85±0.92）%、（100.00±0.56）%，RSD分別為1.01%、0.92%、0.56%（n＝3）。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取不同量的SLB 貯備液于10 ml量瓶中，用流動相定容并制備成5、20、60 μg/ml 的溶液，于同日內重復測定5 次，連續(xù)測定5 d，考察日內、日間精密度。結果，日內RSD 分別為1.22%、0.97%、0.96%（n＝5），日間RSD分別為1.63%、1.18%、0.80%（n＝5）。

2.1.5 重復性試驗 取同一批TMC60-SLBL樣品6份，測定并計算SLB含量。結果，含量的RSD為0.42%（n＝6），表明方法的重復性良好。

2.2 SLBL制備方法的選擇

2.2.1 薄膜分散法 稱取卵磷脂20 mg、膽固醇2 mg、SLB 1 mg 于500 ml 茄形瓶中，加入15 ml 氯仿與乙醇的混合溶劑充分溶解；于45 ℃水浴減壓蒸餾除去有機溶劑，形成均勻透明的薄膜，繼續(xù)抽真空除去殘余溶劑；加入10 ml 生理鹽水水合介質洗膜，于45 ℃恒溫水浴水化1 h，得到乳狀半透明脂質體溶液，并高速剪切分散10 min，密封置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 復乳法 稱取卵磷脂20 mg、膽固醇2 mg、SLB 1 mg 于500 ml梨形瓶中，加入一定體積有機溶劑（體積比為2∶1的三氯甲烷-乙醇）溶解，再加入少量生理鹽水，100 W 超聲乳化5 min，形成乳白色的W/O 型乳液；再于45 ℃水浴減壓蒸餾，除去少量有機溶劑，加入10 ml生理鹽水，形成W/O/W型復乳；溫度保持不變，壓力不變，繼續(xù)蒸餾除盡有機溶劑，形成乳白色懸浮液狀的脂質體，并高速剪切分散10 min，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.3 逆向蒸發(fā)法 稱取卵磷脂20 mg、膽固醇2 mg、SLB 1 mg于500 ml梨形瓶中，加入一定體積有機溶劑（體積比為2∶1的三氯甲烷-乙醇）溶解，再加10 ml生理鹽水超聲5 min，減壓蒸餾，直至形成反膠束凝膠；維持真空，繼續(xù)減壓蒸餾至其塌陷形成乳白色懸浮液狀的脂質體，并高速剪切分散10 min，置于4 ℃冰箱保存。

2.3 包封率的測定[8]

取SLBL 混懸液1 ml，加甲醇超聲破乳，3 500 r/min 離心10 min，取上清液經0.45 μm 的微孔濾膜過濾后，進樣分析，測定SLB總含量Wz。另取SLBL混懸液1 ml，以1 000 r/min離心10 min，除去SLB 結晶，取上層脂質體溶液，于4 ℃下12 000 r/min 離心60 min，收集下層脂質體，用甲醇破乳，離心除去沉淀，經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，進樣測定，得到包載的SLB含量Wb。計算包封率：包封率＝Wb/Wz×100%?！?.2”項下3 種方法制備的SLBL的包封率測定結果見表1。

表1 包封率測定結果（，n＝3，%）Tab 1 Result of encapsulation efficiency（，n＝3，%）

表1 包封率測定結果（，n＝3，%）Tab 1 Result of encapsulation efficiency（，n＝3，%）

注：與剪切前比較，＊P＜0.05Note：vs.before cutting，＊P＜0.05

經SPSS 21 軟件進行t檢驗，薄膜分散法制備的脂質體的包封率在剪切前后差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明薄膜分散法剪切前后的包封率無明顯改變；而復乳法和逆向蒸發(fā)法制備的脂質體的包封率在剪切前后差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即高速剪切對此兩種方法制備的脂質體的包封率影響較大?？梢姳∧し稚⒎ㄖ苽涞腟LBL包封率較高，調整粒徑后對包封率的影響也較小。因此，最終選擇薄膜分散法制備SLBL。

2.4 TMC60-SLBL的制備

稱取卵磷脂、膽固醇、SLB 適量，按照“2.2.1”項下方法制備SLBL初懸液；然后取處方量的TMC60（按與脂材的體積比為1∶4 的量）于40 ml 純水中溶解，將10 ml 脂質體初懸液，以1 ml/min 的速度恒速滴加到上述TMC60 溶液中，攪拌速度為300 r/min；待脂質體完全滴加完畢后，再繼續(xù)攪拌10 min，即得混懸狀包衣脂質體；經高速剪切分散10 min，即得TMC60-SLBL。

2.5 單因素對脂質體包封率的影響

按照文獻[8]，以脂質體包封率為主要考察指標，考察磷脂質量濃度、磷脂-膽固醇質量比、藥脂質量比、水合溫度、水合時間、TMC60的質量濃度對包封率的影響。結果表明，包封率隨著磷脂質量濃度的增加而增大，可能是由于單位體積脂質材料的增加，形成的脂質體數(shù)量也增多，包封藥物的量也隨之增加。膽固醇能夠調節(jié)脂質體膜的流動性和影響膜的通透性，在一定范圍內，包封率隨著膽固醇比例的增大而增大，當膽固醇量過高時，包封率減小[9]。有研究認為，一定條件下，脂質體膜對藥物的包封有一個相對飽和值，因此在低于飽和值時，包封率隨藥脂質量比的增大而增大，超過飽和值時則相反[10]。水合溫度對包封率的影響也較大，溫度過低，磷脂分子的流動性差，不利于藥物的包封；溫度過高，易引起磷脂的氧化，導致包封率減小。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，水合時間過長，磷脂會被氧化成深黃色而使脂質體不穩(wěn)定，短時間內沉淀，同時結合包封率的結果，確定水合時間為1 h。TMC60的質量濃度對包封率無明顯影響（P＞0.05）。因此，選擇對包封率影響較大的磷脂質量濃度、磷脂-膽固醇質量比、藥脂質量比、水合溫度4 個因素進行正交試驗。

2.6 正交試驗優(yōu)化脂質體處方工藝

以磷脂質量濃度（A）、磷脂-膽固醇質量比（B）、藥脂質量比（C）、水合溫度（D）為因素，以包封率為指標，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化處方工藝。因素與水平見表2，正交試驗安排與結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗安排與結果Tab 3 Design and result of orthogonal test

表4 方差分析結果Tab 4 Analysis result of variance

由表3 和表4 可知，各因素對包封率影響大小順序為C＞D＞B＞A；經方差分析，B、C、D 對包封率有明顯影響（P＜0.05）。綜合考慮，最優(yōu)處方工藝組合為A2B3C2D2，即磷脂質量濃度為6 mg/ml，磷脂-膽固醇質量比為40∶1，藥脂質量比為1∶30，水合溫度為45 ℃。

2.7 驗證試驗

按照最優(yōu)處方工藝制備3 批TMC60-SLBL，測定包封率。結果，包封率分別為82.23%、84.62%、79.39%，平均包封率為（82.08±2.6）%，RSD為3.17%（n＝3），說明本處方工藝所制樣品包封率較高，方法重復性較好。

2.8 滲漏率考察[11]

取按照最優(yōu)處方工藝制備的TMC60-SLBL 適量，放入密封好的西林瓶中，置于4 ℃和25 ℃的條件下貯存，于1、7、15、30 d 后取樣1 ml，分別以1 000 r/min 離心10 min，收集下層SLB 結晶。取上層脂質體溶液，于4 ℃下12 000 r/min 離心60 min，收集上層游離SLB，合并兩次收集的SLB后進樣分析，得到游離藥物的量，按公式計算：Q＝（m1－m2）/m3×100%，其中Q為滲漏率，m1為貯存放置一段時間后測得的游離藥物的量，m2為貯存前測得的游離藥物的量，m3為貯存前包封的藥量。TMC60-SLBL在4、25 ℃下的滲漏率-時間曲線見圖1。

圖1 TMC60-SLBL在4、25 ℃下的滲漏率-時間曲線（n＝3）Fig 1 Permeability-time curves of TMC60-SLBL at 4 and 25 ℃（n＝3）

由圖1 可知，脂質體的滲漏率與保存溫度密切相關，TMC60-SLBL在4 ℃貯存的穩(wěn)定性較在25 ℃好。

2.9 粒徑及Zeta電位

取按照最優(yōu)處方工藝制備的TMC60-SLBL 及未包覆TMC60 的SLBL 適量，分別置于樣品池中，分散均勻，采用激光粒度儀測定平均粒徑和和Zeta 電位。結果，TMC60-SLBL和SLBL 的平均粒徑分別為（161.2±2.0）、（131.9±1.9）nm，Zeta電位分別為（36.73±2.84）、（－23.18±1.14）mV（n＝3）。

3 討論

3.1 樣品含量的計算

SLB以一對非對映異構體的形式存在[7]，在高效液相色譜分析中表現(xiàn)為雙峰，2010 年版《中國藥典》規(guī)定含量測定以兩峰面積之和進行定量。

3.2 流動相比例的確定

參照《中國藥典》和文獻[7]，最終將流動相調整為甲醇-水-冰醋酸（54∶46∶0.5）。調整過程中發(fā)現(xiàn)，加大冰醋酸的比例可以抑制峰形拖尾，可能是因為SLB 的化學結構中含有較多的羥基，可以與色譜柱中的硅羥基（吸電子基團）產生作用力。酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，使得硅羥基呈分子狀態(tài)，從而不易吸引SLB中的羥基氫。

3.3 制備方法的確定

本試驗前期采用了薄膜分散法、復乳法、逆向蒸發(fā)法、乙醇注入法等方法來制備SLBL。但在制備的過程中發(fā)現(xiàn)本實驗使用的磷脂和膽固醇微溶于乙醇，雖然通過光學顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有少量脂質體形成，但是不穩(wěn)定，幾個小時后就出現(xiàn)了沉淀，于是舍棄了乙醇注入法。前3種方法都能制備成較穩(wěn)定的脂質體，通過高速剪切機分散，包封率都出現(xiàn)不同程度的降低，可能是因為高速剪切過程中產生的能量高，導致脂質體氧化，藥物發(fā)生滲漏；薄膜分散法制備的多為大多層脂質體（MLV）[12]，而MLV脂質體層數(shù)多，受到高速剪切破壞的程度較小，因此包封率下降程度相對較小，這與文獻[12]的結果類似。除此之外，在使用前3種方法制備脂質體的過程中均使用了有機溶劑，而薄膜分散法可以盡可能迅速且完全地除去有機溶劑。有害有機溶劑的限度檢查擬在后續(xù)研究作補充。

3.4 處方工藝優(yōu)化

本文通過正交試驗篩選出TMC60-SLBL 的最優(yōu)處方，制得產品包封率高、重現(xiàn)性好；與未包覆的SLBL相比，TMC60-SLBL的Zeta 電位由負變正，具有較高的正電性。有研究表明，Zeta電位的絕對值越大（大于15 mV），粒子間的靜電斥力越大，越穩(wěn)定[13]。本實驗中TMC60-SLBL的Zeta電位為（36.73±2.84）mV、粒徑較小，表明穩(wěn)定性良好，為后續(xù)實驗奠定了基礎。

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