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        星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化重樓皂苷類成分的提取工藝Δ

        2015-03-09 11:51:30鞠建峰朱宗敏杜忠科山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科濟(jì)南250014
        中國(guó)藥房 2015年28期
        關(guān)鍵詞:皂苷類星點(diǎn)重樓

        鞠建峰,朱宗敏,杜忠科(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科,濟(jì)南 250014)

        重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmithvar.yunnanensis或七葉一枝花Paris polyphylla var.chinensis的干燥根莖,具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效,臨床主要用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、跌撲傷痛、驚風(fēng)抽搐[1]。現(xiàn)代研究表明,重樓具有止血、抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用[2-3],其主要活性成分為甾體皂苷類成分[4]。

        目前對(duì)重樓皂苷類成分的提取工藝主要是采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)選,但正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法試驗(yàn)精度不夠,建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差[5]。故本研究采用試驗(yàn)精密度較高、預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選重樓總皂苷的提取工藝,以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的提取率為考察指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,優(yōu)化重樓皂苷的提取工藝參數(shù),為重樓藥材的深入研究提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        1260 型高效液相色譜(HPLC)儀(美國(guó)安捷倫公司);TG-16型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);AB135-S型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);UV2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)。

        1.2 藥材、藥品與試劑

        重樓皂苷Ⅰ對(duì)照品(批號(hào):111590-201103,純度:92.1%)、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào):111591-201103,純度:93.4%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;重樓藥材(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥系李峰教授鑒定為云南重樓Paris polyphyllaSmithvar.yunnanensis干燥根莖);乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ和重樓總皂苷的含量測(cè)定

        2.1.1 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量測(cè)定[6-7]采用HPLC法。色譜條件:色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(48∶52),流速為1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為10 μl。經(jīng)方法學(xué)考察,精密度、準(zhǔn)確度、線性關(guān)系、專屬性和靈敏度均符合要求。

        2.1.2 重樓總皂苷的含量測(cè)定[8]采用可見(jiàn)分光光度法。以重樓皂苷Ⅰ為對(duì)照品,高氯酸為顯色劑,水浴65 ℃加熱15 min,在408 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中重樓總皂苷的含量。經(jīng)方法學(xué)考察,精密度、準(zhǔn)確度、線性關(guān)系均符合要求。

        2.2 單因素試驗(yàn)

        2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 取重樓藥材6 份,每份50 g,稱定,分別加6 倍量(體積質(zhì)量比,ml/g)的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇回流提取60 min,提取1次,濾過(guò),測(cè)定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量,并計(jì)算其提取率(提取率=提取所得浸膏質(zhì)量×浸膏中所測(cè)成分的含量/原藥材中所測(cè)成分的含量×100%),結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下重樓皂苷類成分的提取率(%)Tab 1 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different volume fractions of ethanol(%)

        由表1可知,不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)重樓皂苷類成分提取影響較大,因此確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%~80%進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)篩選。

        2.2.2 提取時(shí)間的選擇 取重樓藥材6份,每份50 g,稱定,加6倍量60%乙醇,分別回流提取20、40、60、80、100、120 min,濾過(guò),測(cè)定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量,并計(jì)算其提取率,結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 不同提取時(shí)間下重樓皂苷類成分的提取率(%)Tab 2 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different extraction time(%)

        由表2 可知,各提取時(shí)間對(duì)提取效果影響較大,故確定對(duì)所有提取時(shí)間范圍(20~120 min)進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)篩選。

        2.2.3 溶劑倍量的選擇 取重樓藥材6份,每份50 g,稱定,分別加4、6、8、10、12倍量的60%乙醇回流提取60 min,濾過(guò),測(cè)定提取液中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的含量,并計(jì)算其提取率,結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 不同溶劑倍量下重樓皂苷類成分的提取率(%)Tab 3 The extraction rate of saponins from P.polyphylla under the condition of different amount of solvent(%)

        由表3 可知,各溶劑倍量均對(duì)提取效果有影響,確定選取4~12倍量進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)篩選。

        2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選重樓皂苷提取工藝

        2.3.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì) 為了更精確地考察最優(yōu)因素水平值,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取時(shí)間(X2)和溶劑倍量(X3)為自變量,以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ及重樓總皂苷的提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量,回歸處理較困難,并從節(jié)約成本和工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際考慮,將提取次數(shù)定為2次。同時(shí)為了將所有指標(biāo)綜合成一個(gè)能反映總體效應(yīng)結(jié)果的值,試驗(yàn)中以“總評(píng)歸一值”(Overall desirability,OD)來(lái)考察指標(biāo)的綜合效果,根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]的方法對(duì)各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理。各指標(biāo)由公式(1)計(jì)算di值:di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin),其中Yi為實(shí)測(cè)值,Ymin和Ymax系指每一指標(biāo)在不同次試驗(yàn)中測(cè)得的所有值中的最小和最大值。計(jì)算出各指標(biāo)的di值后,由公式(2)計(jì)算OD 值:OD=(d1×d2……×dn)1/n,n為指標(biāo)數(shù)。根據(jù)Central-Composite的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)各因素進(jìn)行5 水平設(shè)計(jì),用代碼值-α、-1、0、1、α來(lái)表示,見(jiàn)表4;試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表5。

        表4 Central-Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Tab 4 Factors and levels of Central-Composite design

        表5 Central-Composite 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 5 Arrangement and results of Central-Composite design

        2.3.2 模型擬合及方差分析 將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行效應(yīng)面試驗(yàn)分析,以O(shè)D值分別對(duì)各因素X(自變量)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合。結(jié)果,多元線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)(r=0.654 2)較低,變量之間線性相關(guān)性較差,擬合度不佳,預(yù)測(cè)性較差。其中,二項(xiàng)式方程擬合回歸方程為OD=0.42+0.23X1+0.12X2+0.035X3+0.055X1X2+0.031X1X3-0.021X2X3+9.8×10-3X12-0.093X22-0.036X32(r=0.924 0),相關(guān)系數(shù)較高,擬合度較好,預(yù)測(cè)性較好。方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

        表6 效應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果Tab 6 Results of variance analysis of the fitting regression equation with the response surface

        由表6 可知,二項(xiàng)式回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著,說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較??;模型擬合檢驗(yàn)顯著,說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合良好,為成功模型;乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)OD值的影響具有極顯著意義,所有交互項(xiàng)未達(dá)顯著性。

        2.3.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測(cè) 應(yīng)用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行三維效應(yīng)面圖,詳見(jiàn)圖1。

        圖1 各因素對(duì)OD 值的效應(yīng)面圖Fig 1 Response surface of factors to OD value

        由OD 值較高的水平確定最優(yōu)提取條件:X1為80%,X2為100.91 min,X3為10.18 倍(ml/g),OD 最大預(yù)測(cè)值為0.986 0。根據(jù)擬合的二項(xiàng)式回歸方程,得出優(yōu)化條件。鑒于試驗(yàn)操作的可行性,確定最優(yōu)工藝條件為加入80%乙醇10倍量(ml/g),回流提取2次,每次100 min。

        2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 依據(jù)最優(yōu)工藝條件,取重樓藥材3 份,每份50 g,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),將測(cè)定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較,并計(jì)算偏差率[偏差率=(預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值×100%]。結(jié)果,重樓皂苷Ⅰ提取率分別為85.4%、82.7%、87.1%;重樓皂苷Ⅱ提取率分別為85.9%、81.3%、83.6%;重樓總皂苷提取率分別為89.5%、92.1%、90.3%;OD 實(shí)測(cè)平均值0.964 9。預(yù)測(cè)重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ及重樓總皂苷提取率分別為86.2%、84.7%、90.9%,OD 預(yù)測(cè)值為0.986 0,偏差率為2.14%,說(shuō)明二項(xiàng)式擬合效果良好,所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性,所選工藝條件重現(xiàn)性較好。

        3 討論

        重樓藥材中含有多種皂苷成分,有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等[3]。本研究選用含量較高的重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ作為指標(biāo),采用HPLC 法進(jìn)行含量測(cè)定,同時(shí)采用分光光度法測(cè)定總皂苷含量,評(píng)價(jià)指標(biāo)全面,試驗(yàn)結(jié)果可靠。

        參考2010年版《中國(guó)藥典》重樓藥材項(xiàng)下重樓皂苷含量測(cè)定方法[1],對(duì)重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ含量測(cè)定方法進(jìn)行了考察,確定了其最優(yōu)流動(dòng)相比例:乙腈-水(48∶52)。在此條件下重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ峰形良好,達(dá)到基線分離,保留時(shí)間適中,檢測(cè)方便。

        通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑倍量等因素的影響,為星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際和成本,將提取次數(shù)定為2 次,結(jié)果皂苷類成分基本提取完全。由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量,因此未在星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法中對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

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