王振寶等

摘要：細胞質(zhì)雄性不育（CMS）在作物遺傳育種研究中占有重要地位，多種植物的細胞質(zhì)雄性不育均與線粒體基因結(jié)構(gòu)變異及新嵌合基因的產(chǎn)生有關(guān)。為探索線粒體atp6基因與洋蔥CMS的關(guān)系，以13份不育系和11份保持系為材料克隆洋蔥atp6基因編碼序列，測序結(jié)果表明不同材料atp6基因間存在一個C/A多態(tài)性位點，該多態(tài)性位點在不育系和保持系間隨機出現(xiàn)，而不是不育系與保持系的特征差異。蛋白質(zhì)分析表明這一多態(tài)性位點的變異并未改變atp6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。進一步的蛋白比對分析揭示了atp6蛋白在物種間有一定的保守性，特別是第IV跨膜結(jié)構(gòu)域的Arg在所有物種中是高度保守的，也是H+轉(zhuǎn)運所必需的?；赼tp6蛋白序列的系統(tǒng)進化樹顯示細菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、低等藻類以及原生生物，然后高等藻類、苔蘚和蕨類，高等綠色開花植物處于樹的頂端，單子葉植物處于樹的最頂端。

關(guān)鍵詞：洋蔥；雄性不育；atp6基因；系統(tǒng)進化

中圖分類號：Q785文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）01-0010-05

洋蔥（AlliumcepaL.）又名玉蔥、圓蔥、蔥頭等，起源于亞洲西部，屬于百合科蔥蒜屬二年生蔬菜，廣泛種植于世界各地。洋蔥于近代傳入我國，由于具有適應(yīng)性強、耐貯藏和運輸?shù)奶攸c，發(fā)展迅速。洋蔥是類黃酮的重要食物來源之一，對人體的健康有很大的影響，它具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值，在防止心血管疾病、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗過敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[1]。

洋蔥是最早利用雄性不育系育種的蔬菜作物之一，雄性不育的產(chǎn)生通常是由于線粒體基因的插入、缺失、重排等造成的基因突變以及形成新的嵌合基因[2]。在以往的研究中，此類基因主要為能量代謝相關(guān)蛋白（ATP、Cob、Cox和NAD/NADP）基因[3]。atp6基因是重要的線粒體功能基因，編碼F1F0-ATP合成酶系統(tǒng)中F0部分最大亞基——A亞基[4]。目前已知水稻、油菜、蘿卜、大豆的雄性不育與atp6基因的突變有關(guān)[5～8]。前人的研究表明，在S（Sterile）型細胞質(zhì)與N/T（Normal）型細胞質(zhì)之間，atp6基因的編碼序列存在一個堿基的突變[9，10]，該突變是否是導(dǎo)致雄性不育的原因目前尚無定論。本研究克隆了洋蔥13個不育系與11個保持系的atp6基因，對其核酸和編碼蛋白序列進行了生物信息學(xué)及進化樹分析，以期通過單倍型的分布和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，探究atp6基因是否是導(dǎo)致洋蔥雄性不育的直接原因。

1材料與方法

1.1試驗材料

以13份雄性不育系（110，118，502，503，101，117-5，117-11-1，117-10-1，117-10-2，117-10-3，L701，L702和L703）和11份保持系（210，218，602，603，202，217-5，217-11-1，217-10-1，217-10-2，217-10-3和L801）為材料進行基因克隆[11]。洋蔥新鮮葉片采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2洋蔥基因組總DNA的提取

洋蔥基因組總DNA的提取采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京），方法參照操作說明書。

1.3洋蔥atp6基因克隆

本研究所用的上游引物P1：5′-ATGAGTGCTGAAAGTAGGAAAGAGTA-3′，下游引物P2：5′-TCAATGTTGATATGACTCATTTTGATG-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)總體積為25μl，其中模板（基因組DNA）1μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，10×LATaqbuffer2.5μl，引物各1μl，TaKaRaLATaq0.25μl，用滅菌蒸餾水補齊至25μl。擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃保溫10min，4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照記錄。目的條帶用凝膠回收試劑盒（Tiangen，北京）回收，與克隆載體pMD18-T（寶生物，大連）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選、菌液PCR鑒定后，將陽性克隆送博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.4序列分析

利用DNAMAN和Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）進行序列比對；SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）用于蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析；MEGA5用于系統(tǒng)進化樹分析。

2結(jié)果與分析

2.1洋蔥atp6基因的克隆與序列特征

PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖1）顯示，擴增片段大小約為800bp，與預(yù)期片段大小相吻合。將陽性克隆進行序列測定及分析后發(fā)現(xiàn)，24個洋蔥育種系的atp6基因間存在一個多態(tài)性位點C/A，且該多態(tài)性位點在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系間均隨機出現(xiàn)（表1）。這一結(jié)果表明，C/A多態(tài)性位點的突變并不是不育系或者保持系所特有的共性突變。

洋蔥atp6基因編碼蛋白序列與已報道其他物種同源序列相似度從40%到90%不等，相似度最高的物種為海棗（Phoenixdactylifera），最低的為印度洋大洋桿菌（Oceanibaculumindicum）。其中第IV跨膜結(jié)構(gòu)域的Arg在所有物種中是高度保守的，也是H+轉(zhuǎn)運所必需的。

為進一步了解atp6蛋白的進化、分類以及作為系統(tǒng)進化研究材料的可能性，對101條來自不同物種的atp6蛋白序列進行序列聯(lián)配，并用ML法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進化樹直觀地顯示了高等綠色植物、藻類、真菌、細菌和病毒之間的親緣關(guān)系（圖3）。細菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開花植物分支內(nèi)部，所有的雙子葉植物均處于一個大的分支上，單子葉植物存在多個分支，且單子葉植物處于樹的最頂端。

3結(jié)論與討論

本試驗以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個多態(tài)性位點C/A，這個多態(tài)性位點在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系之間隨機出現(xiàn)。該多態(tài)性位點堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門yr，然而第一跨膜結(jié)構(gòu)域起始位點為第34位，并未引起atp6跨膜結(jié)構(gòu)域的變化，說明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點的變異，并不是造成洋蔥細胞質(zhì)雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進化樹分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據(jù)物種類型聚類的，可以明顯的劃分為四類，細菌和病毒，真菌、低等藻類和原生生物，高等藻類、苔蘚和蕨類，及高等綠色開花植物。細菌和病毒位于樹的基部，說明其在進化地位上是最原始的類型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類，然后是高等藻類、苔蘚和蕨類，高等植物處于樹的頂端，且單子葉植物處于樹的最頂端，這個結(jié)果符合生物起源與進化的關(guān)系[12]。系統(tǒng)進化樹的分析結(jié)果也支持高等綠色植物和現(xiàn)代藻類均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點[13]。在高等綠色開花植物分支內(nèi)部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個分支，單子葉植物內(nèi)部也存在多個不同起源，這說明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經(jīng)產(chǎn)生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進化的先后順序，但atp6基因的進化與物種的進化并不是完全同時發(fā)生的。

參考文獻：

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為進一步了解atp6蛋白的進化、分類以及作為系統(tǒng)進化研究材料的可能性，對101條來自不同物種的atp6蛋白序列進行序列聯(lián)配，并用ML法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進化樹直觀地顯示了高等綠色植物、藻類、真菌、細菌和病毒之間的親緣關(guān)系（圖3）。細菌和病毒位于樹的基部，其次是真菌、原生生物以及綠藻，然后是高等植物。在高等綠色開花植物分支內(nèi)部，所有的雙子葉植物均處于一個大的分支上，單子葉植物存在多個分支，且單子葉植物處于樹的最頂端。

3結(jié)論與討論

本試驗以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個多態(tài)性位點C/A，這個多態(tài)性位點在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系之間隨機出現(xiàn)。該多態(tài)性位點堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門yr，然而第一跨膜結(jié)構(gòu)域起始位點為第34位，并未引起atp6跨膜結(jié)構(gòu)域的變化，說明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點的變異，并不是造成洋蔥細胞質(zhì)雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進化樹分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據(jù)物種類型聚類的，可以明顯的劃分為四類，細菌和病毒，真菌、低等藻類和原生生物，高等藻類、苔蘚和蕨類，及高等綠色開花植物。細菌和病毒位于樹的基部，說明其在進化地位上是最原始的類型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類，然后是高等藻類、苔蘚和蕨類，高等植物處于樹的頂端，且單子葉植物處于樹的最頂端，這個結(jié)果符合生物起源與進化的關(guān)系[12]。系統(tǒng)進化樹的分析結(jié)果也支持高等綠色植物和現(xiàn)代藻類均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點[13]。在高等綠色開花植物分支內(nèi)部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個分支，單子葉植物內(nèi)部也存在多個不同起源，這說明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經(jīng)產(chǎn)生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進化的先后順序，但atp6基因的進化與物種的進化并不是完全同時發(fā)生的。

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3結(jié)論與討論

本試驗以13份雄性不育系和11份保持系為材料克隆了洋蔥atp6基因，序列分析表明，不同材料的洋蔥atp6基因在92bp處存在一個多態(tài)性位點C/A，這個多態(tài)性位點在不育系內(nèi)、保持系內(nèi)以及不育系和保持系之間隨機出現(xiàn)。該多態(tài)性位點堿基的突變（C-A）使得第31位Ser突變?yōu)門yr，然而第一跨膜結(jié)構(gòu)域起始位點為第34位，并未引起atp6跨膜結(jié)構(gòu)域的變化，說明洋蔥atp6基因在該多態(tài)性位點的變異，并不是造成洋蔥細胞質(zhì)雄性不育的直接原因。

系統(tǒng)進化樹分析表明，atp6基因編碼蛋白在整體上是根據(jù)物種類型聚類的，可以明顯的劃分為四類，細菌和病毒，真菌、低等藻類和原生生物，高等藻類、苔蘚和蕨類，及高等綠色開花植物。細菌和病毒位于樹的基部，說明其在進化地位上是最原始的類型，其次是真菌、原生生物以及低等藻類，然后是高等藻類、苔蘚和蕨類，高等植物處于樹的頂端，且單子葉植物處于樹的最頂端，這個結(jié)果符合生物起源與進化的關(guān)系[12]。系統(tǒng)進化樹的分析結(jié)果也支持高等綠色植物和現(xiàn)代藻類均與Mesostigmaviride（原始綠藻）具有共同祖先的觀點[13]。在高等綠色開花植物分支內(nèi)部，單子葉植物的洋蔥、海棗和雙子葉植物處于一個分支，單子葉植物內(nèi)部也存在多個不同起源，這說明在單、雙子葉植物分化以前atp6基因已經(jīng)產(chǎn)生了分化，或者是單、雙子葉植物存在不同的起源[12]，因此，atp6基因在一定程度上能夠反映物種進化的先后順序，但atp6基因的進化與物種的進化并不是完全同時發(fā)生的。

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[8]韓利濤，楊守萍，喻德躍，等.大豆細胞質(zhì)雄性不育系與保持系atp6基因的RNA編輯比較研究[J].大豆科學(xué)，2010，29（3）：361-365.

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