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短篇論著

可溶性NKG2D配體降低NK細胞對骨髓瘤細胞殺傷功能的研究

韓文敏1, 賈祝霞1, 姜玉1, 朱志超2, 張修文2,

肖溶1, 楊建和1, 盧緒章1

(江蘇省常州市第二人民醫(yī)院, 1. 血液科; 2. 中心實驗室, 江蘇 常州, 213003)

關鍵詞:NKG2D配體; 自然殺傷細胞; 多發(fā)性骨髓瘤; 殺傷功能

人自然殺傷細胞(NK細胞)是人體抗腫瘤免疫的第一道防線，NK細胞通過識別自我的MHCⅠ類分子或Ⅰ類分子樣的獨特受體，可以識別和殺傷體內(nèi)的腫瘤細胞[1-2]。體外實驗[3-4]證實NK細胞對骨髓瘤細胞細胞具有很強的殺傷能力，但是腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細胞可以逃逸免疫細胞的識別和殺傷，而且通過NK細胞輸注治療骨髓瘤患者并沒有得到預期的效果，說明MM患者體內(nèi)環(huán)境抑制NK細胞功能。作者以前的研究[5-6]表明NKG2D介導免疫細胞對骨髓瘤細胞的殺傷作用，作者通過檢測MM患者血清中可溶性NKG2D配體水平變化，并通過細胞株模型探討可溶性的NKG2D配體對NK細胞抗骨髓瘤能力的影響。

1材料與方法

1.1　一般資料

選取2009年3月—2013年12月在本院確診的13例MM患者，中位年齡63歲(41～89歲)，所有患者均符合國內(nèi)MM診斷標準，設為實驗組。以30名健康志愿者為正常對照，中位年齡59歲(45～82歲)，對照組均無腫瘤及自身免疫性疾病史。收集的血清放在-20 ℃凍存，然后統(tǒng)一檢測。

1.2　細胞及主要試劑

骨髓瘤細胞株U266由上海長征醫(yī)院侯健教授惠贈，用含有10%滅活胎小牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素的PRMI1640培養(yǎng)液，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。流式細胞術抗體為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品流式細胞抗體包括CD3-Percp、CD56-FITC、NKG2D-PE及NK細胞分離試劑盒購買于R&D Systems公司。用于sMICA、sMICB檢測的ELISA試劑盒購于北京來博生物科技公司。Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)購于Nunc公司。流式細胞儀(BD FACS Canto Ⅱ)為BD公司。

1.3　研究方法

1.3.1流式細胞儀(FCM)測定：取待標記的細胞1×105/100 mL，分別加入4 μL熒光抗體，4 ℃避光反應30 min后用PBS洗2遍，用300 mL的PBS懸浮后上機檢測，每標本記錄細胞數(shù)為1×104個。利用FlowJO 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.2ELISA檢測可溶性NKG2D配體水平：按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀于波長450 mm處測定吸光度(A)值，并計算出待測標本可溶性NKG2D配體(sMICA、sMICB)的表達水平。

1.3.3NK細胞分離和培養(yǎng)：將健康人單個核細胞用PBS洗滌2次，按NK細胞分離試劑盒說明書進行操作，分離純化的NK細胞用含有10%FBS、100 U/mL IL-2、50 U/mL青霉素、50 UG/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并檢測其表面NKG2D受體的表達水平。

1.3.4Transwell實驗: Transwell上室加入2×105/200 mL的NK細胞懸液，對照組下室加入10%血清的1640培養(yǎng)液600 mL, 實驗組下室加入2×105/600 mL的U266細胞。每組3個復孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后檢測NK細胞表面NKG2D受體的表達或用作效應細胞。

1.3.5NK細胞的細胞毒性試驗：根據(jù)作者以前應用的方法[5]，骨髓瘤細胞U266預選用0.1 μM Calcein acetoxymethyl ester (CAM)孵育15 min后，標定的U266用PBS洗2次，然后用培養(yǎng)液重新調整細胞濃度，并按照5×105/孔放到圓底的96孔板中，然后按照的E︰T比值為10加入NK細胞，在培養(yǎng)箱里一起孵育8 h后用PBS洗1次，然后用結合緩沖液重新混懸細胞，然后用加入7-AAD抗體在常溫中孵育15 min后用流式細胞儀檢測特異性殺傷。特異性殺傷用百分比用公式：特異性殺傷(%)=(CT-TE/CT)×100% (CT表示在對照孔中活細胞的所占的比率，TE表示測試管中活細胞所占的比率)。

2結果

2.1　骨髓瘤患者血清可溶性NKG2D配體濃度

水平變化

比較健康人和初診的多發(fā)性骨髓瘤患者外周血清中可溶性NKG2D配體的濃度，ELISA方法檢測血清中NKG2D配體的濃度。多發(fā)性骨髓瘤患者外周血清中sMICA和sMICB的濃度分別是(156.4±47.1) ng/L和(106.2±35.3) ng/L，明顯高于正常人的(57.2±26.7) ng/L和(44.6±23.5) ng/L(P<0.001)。

2.2　骨髓瘤細胞U266培養(yǎng)上清中可溶性

NKG2D配體的濃度

U266細胞培養(yǎng)24、48、72 h后用ELISA檢查培養(yǎng)上清中NKG2D配體的濃度，隨著培養(yǎng)時間的增多，骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清中NKG2D配體的濃度逐漸增加。見表1。

表1　U266培養(yǎng)上清中sMICA和sMICB的表達水平　ng/L

2.3　可溶性NKG2D配體對NK細胞表面NKG2D受體及殺傷功能的影響

U266和NK細胞在Transwell共培養(yǎng)48 h檢測NK細胞表面NKG2D受體，實驗組NK細胞表面的NKG2D受體表達為(66.5±5.8)%，明顯低于對照組的(96.8±7.4)%。作者用NK細胞為效應細胞，骨髓瘤細胞U266為靶細胞，檢測NK細胞對U266特異性殺傷，實驗組的NK細胞對U266特異性殺傷為(42.3±10.7)%，低于對照組的(62.8±15.6)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3討論

人自然殺傷細胞是腫瘤生物治療常用的一類免疫細胞，NK細胞的殺傷活性是通過其表面的活化型受體介導的NK細胞激活[7-8]，其中NKG2D是NK細胞表面重要的活化型受體，它可以識別腫瘤細胞表面相應的NKG2D配體從而殺傷腫瘤細胞，對NK細胞活性的調控起重要作用[9-11]。但是腫瘤細胞的金屬蛋白酶可以水解細胞表面的NKG2D配體，從而形成可溶性NKG2D配體分子，誘導腫瘤細胞逃逸NK細胞識別和殺傷[12]。作者以前的研究表明患者的骨髓瘤細胞表面表達一定水平的NKG2D配體，免疫細胞通過NKG2D受體和配體的相互作用殺傷骨髓瘤細胞。作者進一步檢測MM患者血清中可溶性NKG2D配體的濃度，發(fā)現(xiàn)MM患者血清中可溶性的NKG2D配體分子(sMICA，sMICB)明顯高于健康人(P<0.001), 可溶性NKG2D配體可能是體內(nèi)影響NK細胞功能的重要因素。

為了驗證可溶性NKG2D配體對NK細胞功能的影響，作者以骨髓瘤細胞株U266為模型，驗證骨髓瘤細胞分泌的可溶性NKG2D配體對NK細胞殺傷作用的影響。作者以前的研究[13]發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞株U266表達一定水平的MICA/B蛋白分子，其培養(yǎng)上清可檢測到一定水平的sMICA/B，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，其上清中sMICA/B濃度逐漸升高。作者用Tanswell共培養(yǎng)U266細胞和NK細胞48 h后可以發(fā)現(xiàn)NK細胞表面的NKG2D受體表達水平明顯下降，同時U266共培養(yǎng)的 NK細胞對骨髓瘤細胞U266的殺傷作用明顯降低，這說明骨髓瘤細胞分泌的可溶性的NKG2D配體分子通過降低NK細胞表面的NKG2D受體表達，從而降低了NKG2D介導的NK細胞對骨髓瘤細胞的殺傷作用。

本研究表明，骨髓瘤細胞能夠分泌可溶性sMICA/B配體分子，降低NK細胞表面NKG2D受體的表達，從而導致了NK細胞抗腫瘤能力的下降，這可能是MM患者體內(nèi)NK細胞抗腫瘤能力下降的原因。改善腫瘤患者內(nèi)環(huán)境，降低體內(nèi)可溶性NKG2D配體分子水平，可能會改善體內(nèi)免疫細胞抗腫瘤能力，從而提高患者的無病生存時間及總生存時間。

參考文獻

[1]Cooper M A, Fehniger T A, Caligiuri M A. The biology of human natural killer-cell subsets[J]. Trends Immunol, 2001, 22(11): 633.

[2]Pende D, Cantoni C, Rivera P, et al.Role of NKG2D in tumor cell lysis mediated by human NK cells: cooperation with natural cytotoxicity receptors and capability of recognizing tumors of nonepithelial origin[J].Eur J Immunol, 2001, 31(4): 1076.

[3]Garg T K, Szmania S, Mkhan JA, et al.Highly activated and expanded natural killer cells for multiple myeloma immunotherapy [J].Haematologica, 2012, 97(9): 1348.

[4]Alici E, Konstantinidis K V, Sutlu, T, et al. Anti-myeloma activity of endogenous and adoptively transferred activated natural killer cells in experimental multiple myeloma model[J]. Exp Hematol, 2007, 35(12): 1839.

[5]Lu X, Zhu A, Cai X, et al.Role of NKG2D in cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells[J]. Cancer Biol Ther, 2012, 13(8): 623.

[6]盧緒章, 蔡曉輝, 馬玲娣, 等.NKG2D介導正常人NK細胞對白血病細胞的殺傷作用[J]. 中華血液學雜志, 2012, 33(6): 444.

[7]Purdy A K, Campbell K S. Natural killer cells and cancer: regulation by the killer cell Ig-like receptors (KIR)[J]. Cancer Biol Ther, 2009, 8(23): 2211.

[8]Miller J S. The biology of natural killer cells in cancer, infection, and pregnancy[J]. Exp Hematol, 2001, 29(10): 1157.

[9]Boerman G H, van Ostaijen-Ten Dam M M, Kraal K C, et al. Role of NKG2D, DNAM-1 and natural cytotoxicity receptors in cytotoxicity toward rhabdomyosarcoma cell lines mediated by resting and IL-15-activated human natural killer cells[J]. Cancer Immunol Immunother, 2015, 64(5): 573.

[10]Gilfillan S, Ho E L, Cella M, et al. NKG2D recruits two distinct adapters to trigger NK cell activation and costimulation[J]. Nat Immunol, 2002, 3(12): 1150.

[11]Fernandez-Messina L, Reyburn HT, Vales-Gomez M.Human NKG2D-ligands: cell biology strategies to ensure immune recognition[J]. Front Immunol, 2012, 3: 299.

[12]Salih H R, Holdenrieder S, Steinle A. Soluble NKG2D ligands: prevalence, release, and functional impact[J]. Front Biosci, 2008, 13: 3448.

[13]何金媛, 賈祝霞, 蔡曉輝, 等. NKG2D在細胞因子誘導的殺傷性細胞(CIK)抗血液腫瘤細胞的作用[J]. 中國試驗血液學雜志, 2013, 21(6): 1380.

通信作者:盧緒章, E-mail: luxuzhang2008@163.com

基金項目:江蘇省常州市衛(wèi)生局重大科技項目(ZD201311)

收稿日期:2015-06-17

中圖分類號:R 551.3

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)24-134-02

DOI:10.7619/jcmp.201524053