高湘湘，林 蘭，葛伯建

(南通大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內科，江蘇南通，226001)

原發(fā)性肺癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，2012中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒顯示肺癌死亡率占據(jù)惡性腫瘤死亡率的首位，達到45.57/10萬。其中，非小細胞肺癌(NSCLC)約占全部肺癌的80%。抑癌基因失活是肺癌發(fā)生、發(fā)展的關鍵步驟［1］。這些基因的異常改變，除與肺癌的發(fā)生有關外，還與其浸潤、轉移和復發(fā)有關，間接或直接地影響到肺癌的預后［2］。DLC-1基因，定位于第8號染色體短臂(8p21.3～22)。該基因為大鼠p122基因的人類同源基因，二者有92.5%相似性［3］。作者通過檢測DLC-1基因在早期肺癌組織中的表達狀況，并與肺癌患者臨床特征進行綜合分析，來探討DLC-1基因與肺癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院2012年6月—2014年1月經(jīng)手術切除并經(jīng)由病理科確診的肺癌患者72例，其中男45例，女27例，年齡56～79歲，平均61歲。以正常開胸取得的其他疾病患者的9例良性病變組織作為對照?；颊呷〔那熬唇邮苓^放療和化療，肝、腎功能正常，排除孕婦、哺乳期婦女、精神疾病患者。每例肺癌標本均有癌旁正常組織作為對照。手術切除標本后立即置入液氮冷卻，再轉移至－70℃冰箱長期保存。

1.2 主要儀器

U-2001型紫外分光光度計定量(日本日立公司);德國 Biometra溫度梯度 PCR擴增儀;ECPS3000/150電泳儀;美國 BECKMAN AllegraTM RA 64R高速低溫離心機;美國BIO-RAD公司凝膠圖像分析儀。

1.3 總RNA的提取

對晚期肺癌組織、癌旁組織分別提取總RNA，紫外分光光度計定量?？俁NA的提取采用OMEGA RNA提取試劑盒提取，具體步驟參照說明書，提取的總RNA立即置于－70℃保存。

1.4 逆轉錄反應

對肺癌組織、癌旁組織和良性病變組織分別取3μg總RNA按照試劑盒反應體系逆轉錄。B-actin作為內參照，DLC-1基因及B-act in引物序列合成均由上海生工公司設計合成，DLC-1基因mRNA引物正義鏈:5'-GCTT GTGAT TGGCTACGG-3'反義鏈:5'-CCACCTCTTGCTGTCCCT-3'。B-actin mRNA引物(內參)正義鏈:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'反義鏈:5'-GTT T TCT GC GCAAGT TAGG-3'。反應條件為:預變性95℃ 5 min，94℃，30 s，溫度退火30 s，72℃1 min共35個循環(huán);72℃ 延伸10 min。取5μL擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照顯帶觀察DLC-1基因的表達狀況。

2 結果

2.1 DLC-1基因的表達狀況

60例肺癌標本中，22例表達陽性;與之相對應的是癌旁組織49例表達陽性，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。9例良性病變組織中，有7例mRNA表達陽性，與肺癌組有顯著差異(P＜0.05)。見圖1。

圖1 DLC-1基因的表達狀況顯示

2.2 DLC-1基因的表達狀況與肺癌臨床特征的關系

60例肺癌組織中，DLC-1基因的表達狀況隨TNM分期及浸潤深度增加而下調明顯(P＜0.05)。見表1。

表1 DLC-1基因mRNA的表達水平與肺癌患者臨床特征的關系

3 討論

DLC-1基因當前被認為是一個新的抑癌基因，在正常組織中表達基本正常，但在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌及等人類腫瘤中存在表達缺失現(xiàn)象［4－6］。通過 RT-PCR 方法對肺癌組織、癌旁組織和良性病變組織進行DLC-1基因擴增檢測，作者發(fā)現(xiàn)DLC-1基因的表達缺失與肺癌的發(fā)生密切相關。肺癌的癌旁組織標本中，DLC-1基因表達陽性率高達82%，而肺癌組織中僅為37%，二者差異顯著(P＜0.01)。9例良性病變組織中，有7例mRNA表達陽性，與肺癌組差異顯著(P ＜0.05)。Yuan等［7］研究結果與作者相近，他們報道在超過50%的原發(fā)性肝細胞癌組織及大多數(shù)細胞系中存在DLC-1基因的缺失，在28%的肝細胞系中檢測不到DLC基因的表達。本研究結果為DLC-1基因的低表達在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要作用提供了強有力的支持。

本研究將DLC-1基因mRNA的表達水平與肺癌患者臨床特征關聯(lián)后，作者發(fā)現(xiàn)DLC-1基因表達的缺失與腫瘤的分期顯著相關。對于分期為Ⅰ期的患者，表達陽性與陰性的比例相當，但是對于Ⅱ期和Ⅲ期患者，DLC-1基因表達缺失的比例明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義。

越來越多的研究［8－11］顯示，DLC-1 基因符合抑癌基因的標準。DLC-1定位于人類染色體8p21-22，這一區(qū)域在很多惡性腫瘤中經(jīng)常發(fā)生缺失，如腸癌、肝癌、前列腺癌等。所有這些證據(jù)表明，通過基因組表達缺失或者DNA甲基化，DLC-1可能是腫瘤細胞中基因表達失活的高發(fā)位點。Wilson等［12］在DLC基因上選取了3個微衛(wèi)星位點，對100例原發(fā)性肝癌組織進行了雜合性缺失分析，結果3個微衛(wèi)星位點的雜合性缺失率分別為44.3%、44.4%和50%，結果表明在原發(fā)性肝細胞癌中DLC-1等位基因的缺失為常見現(xiàn)象。

雖然已知DLC-1基因失活在肺癌發(fā)生中起著重要作用，但是目前尚未明確其具體的失活機制。迄今為止，在人類肝細胞癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了DLC-1基因的缺失，在肝癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌和前列腺癌中都發(fā)現(xiàn)了DLC-1啟動子區(qū)域的DNA甲基化異常［13］。DLC-1基因的點突變僅僅發(fā)生在幾種不同的實體腫瘤亞群中，表明點突變并不是肺癌中DLC-1基因失活的主要機制［14］。

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