顧文菊邱波（湖北省黃石市第五醫(yī)院普內(nèi)科黃石435005）

黃芩素靶向p38 MAPK通路抗肺纖維化的作用機(jī)制研究

顧文菊邱波
（湖北省黃石市第五醫(yī)院普內(nèi)科黃石435005）

摘要：目的：探討黃芩素（baicalein）抗肺纖維化（PF）的療效，并通過(guò)測(cè)定p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化程度，探討其可能的作用機(jī)制。方法：6周齡健康SD雄性大鼠96只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組）、肺纖維化模型組（M組）、p38 MAPK抑制劑SB 203580組（S組）和黃芩素組（B組），每組24只。造?；蛑委熀罄肊LISA法檢測(cè)血漿中促炎細(xì)胞因子高遷移率族蛋白B1 （HMGB1）及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子1（CINC-1）的水平；比色法測(cè)定肺組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性；Real-time PCR法觀察結(jié)腸組織p38及p-p38基因表達(dá)水平。結(jié)果：M組大鼠血漿HMGB1、CINC-1均明顯升高（P＜0.01），肺組織MPO活性升高（P＜0.01），p38磷酸化程度顯著升高（P＜0.05）；與M組比較，S組和B組大鼠血漿HMGB1、CINC-1均明顯降低（P＜0.01），肺組織MPO活性下降（P＜0.01），p38磷酸化程度顯著下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論：黃芩素減輕博來(lái)霉素（BLM）誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，其作用機(jī)制可能與抑制p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肺纖維化；黃芩素；靶向p38 MAPK通路；作用機(jī)制

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是一種病因不明的慢性肺部疾病，屬于肺間質(zhì)纖維化的一種[1]，主要表現(xiàn)為纖維結(jié)締組織在肺泡間隔彌漫增生引起肺組織結(jié)構(gòu)毀損、順應(yīng)性減低、彌散功能障礙，最終導(dǎo)致呼吸衰竭[2~3]。肺纖維化的發(fā)病機(jī)理不明，也缺乏有效治療，因此研究肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律以及探討新的有效防治手段是目前基礎(chǔ)和臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。本文對(duì)黃芩素（baicalein）治療PF做了初步探討，現(xiàn)報(bào)道如下：

1　材料和方法

1.1動(dòng)物及分組6周齡健康SD雄性大鼠96只，購(gòu)自河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有操作程序獲得河

南大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組）、肺纖維化模型組（M組）、p38 MAPK抑制劑SB 203580組（S組）和黃芩素組（B組），每組24例。

1.2模型制備及處理參照李玉花等[4]的方法，M組以BLM制備PF模型，即大鼠乙醚吸入麻醉，操作臺(tái)仰臥位固定，頸部消毒，切開(kāi)頸部皮膚，逐層剝離，暴露氣管，用一次性1 ml注射器抽取0.2~0.3 ml博萊霉素生理鹽水溶液（5 mg/kg體重），向氣管內(nèi)注入，注射后立即將大鼠直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，縫合皮膚，手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作。C組給予等體積生理鹽水，S組和B組模型分別在BLM造模后第1天開(kāi)始前連續(xù)腹腔注射SB 203580、黃芩素。

1.3方法

1.3.1 ELISA法檢測(cè)血漿HMGB1、CINC-1水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）進(jìn)行血漿促炎細(xì)胞因子高遷移率族蛋白B1（HMGB1）及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子1（CINC-1）水平測(cè)定，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2比色法測(cè)定肺組織MPO活性準(zhǔn)確稱(chēng)量各待檢大鼠肺組織，用0.9%生理鹽水按1∶9制成10%勻漿，勻漿液直接分為兩部分：一部分根據(jù)Bradford's方法，用蛋白定量分析試劑盒測(cè)上清液中蛋白濃度；另一部分用市售MPO檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作對(duì)肺臟組織中MPO活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 Real-time PCR法檢測(cè)p38、p-p38 MAPK mRNA表達(dá)留取部分肺組織立即投入液氮。從組織中提取總RNA：將整個(gè)胃組織剪碎，放入2 ml試管內(nèi)，用Trizle法提取RNA；用分光光度法測(cè)定所提取RNA的濃度；RNA電泳檢測(cè)其完整性（1%瓊脂糖凝膠）；mRNA反轉(zhuǎn)錄：嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作；PCR檢測(cè)：采用primer premier 5.0設(shè)計(jì)p38、p-p38 MAPK及GAPDH基因引物序列，將每個(gè)cDNA樣品2 L進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)標(biāo)本做復(fù)孔檢測(cè)。用FTC 3000系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本mRNA拷貝數(shù)，p38、p-p38 MAPK mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別用p38、p-p38 MAPK mRNA拷貝數(shù)與GAPDH mRNA拷貝數(shù)的比值表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血漿HMGB1、CINC-1水平改變M組的HMGB1和CINC-1水平與C組比較明顯升高，差異均具有顯著意義（P＜0.01），S組和B組HMGB1、CINC-1水平均比M組明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1　血漿HMGB1、CINC-1水平改變（%，x±s）

2.2肺組織MPO活性變化與C組比較，M組大鼠MPO活性明顯升高，而SB 203580和黃芩素處理可明顯降低M組大鼠肺組織MPO活性。見(jiàn)表2。

表2　肺組織MPO活性改變

2.3p38、p-p38 mRNA表達(dá)的改變p38和p-p38基因表達(dá)情況，M組p-p38/p38比值較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），而SB 203580和黃芩素處理組較M組顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3　p38、p-p38 mRNA表達(dá)的改變（%，x±s）

3　討論

PF加重期病情進(jìn)展快，發(fā)生呼吸衰竭和死亡的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高，目前尚無(wú)特效療法。慢性炎癥是纖維化的早期階段，因此控制炎癥可有效阻斷纖維化進(jìn)程。隨著全世界對(duì)天然藥物的開(kāi)發(fā)越來(lái)越重視，從天然產(chǎn)物中尋找安全、有效、低毒的活性成分已經(jīng)成為抗肺纖維化藥物研發(fā)的新方向。黃芩是一味具有抑炎、抗菌、抗病毒、抗氧化作用的中藥，黃芩素和黃芩苷是其主要組成及活性成分，其中以黃芩苷的含量最高，其次是黃芩素，而黃芩苷通過(guò)在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化成黃芩素發(fā)揮作用。研究[5]發(fā)現(xiàn)，黃芩總黃酮對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化具有明顯的干預(yù)作用，為了進(jìn)一步探索黃芩素的抗纖維化作用。本研究觀察了黃芩素對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化的治療作用，發(fā)現(xiàn)黃芩素明顯降低大鼠血漿HMGB1、CINC-1水平、肺組織MPO活性變化。

多條信號(hào)通路參與了對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其中p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用。P38 MAPK信號(hào)通路激活后，促使下游IL-1、IL-6、TNF-琢等炎癥介質(zhì)基因表達(dá)上調(diào)、炎癥因子釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[6]；同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子、趨化分子的表達(dá)上調(diào)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，M組大鼠肺組織p38磷酸化程度明顯升高，說(shuō)明肺纖維化時(shí)p38 MAPK被激活，應(yīng)用其特異性抑制劑明顯抑制p38激活，并降低大鼠血漿HMGB1、CINC-1水平、肺組織MPO活性；黃芩素在降低大鼠血漿HMGB1、CINC-1水平、肺組織MPO活性的同時(shí)抑制p38 MAPK激活。綜上所述，黃芩素對(duì)肺纖維化大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與阻斷p38MAPK通路有關(guān)

。

參考文獻(xiàn)

[1]Katzenstein AL,Myers JL.Idiopathic pulmonary fibrosis:clinical relevance of pathologic classification[J].Am J Respir Crit Care Med, 1998,157(4 Pt 1):1301-1315

[2]Prasse A,Holle JU,Muller-Quernheim J,et al.Pulmonary fibrosis[J]. Internist (Berl),2010,51(1):6-13

[3]Kuwano K.Involvement of epithelial cell apoptosis in interstitial lung diseases[J].Intern Med,2008,47(5):345-353

[4]李玉花,許先榮,潘慶,等.大黃素對(duì)肺纖維化大鼠TGF-茁1及smad3/7信號(hào)通路的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,28(2):346-347

[5]馬榮林,王尉平,蔣小崗,等.黃芩總黃酮對(duì)博萊霉素致大鼠肺纖維化的干預(yù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011,27(4):537-542

[6]Feng YJ,Li YY.The role of p 38 mitogen-activated protein kinase in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J].J Dig Dis,2011,12 (5):327-332

[7]Scaldaferri F,Sans M,Vetrano S,et al.The role of MAPK in governing lymphocyte adhesion to and migration across the microvasculature in inflammatory bowel disease[J].Eur J Immunol,2009,39(1):290-300

收稿日期：（2015-03-23）

中圖分類(lèi)號(hào)：R563

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.08.009