范強(qiáng)，陶秉春，王博，張責(zé)研，曾瑞，安立會,*

1. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384 2. 中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012

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銅銹環(huán)棱螺室內(nèi)實驗條件優(yōu)化

范強(qiáng)1,2，陶秉春1，王博2，張責(zé)研2，曾瑞2，安立會2,*

1. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384 2. 中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012

銅銹環(huán)棱螺作為一種新興的潛在生態(tài)毒理學(xué)模式生物，適宜實驗條件是開展其室內(nèi)毒理學(xué)研究的基礎(chǔ)。在人為控制條件下，初步探討了餌料、水深、底質(zhì)、密度和鈣離子濃度養(yǎng)殖條件對銅銹環(huán)棱螺成體生長的影響，并進(jìn)一步對麻醉條件進(jìn)行了篩選(MgCl2·2H2O、乙醇、丁香酚、鹽酸普魯卡因和MS-222)。結(jié)果表明：當(dāng)投喂冰鮮小球藻、密度6 個·L-1水體積、水深10～15 cm、泥土底質(zhì)并且水中鈣離子濃度30 mg·L-1時，銅銹環(huán)棱螺的體重增長最為明顯。麻醉效果表明，MgCl2·2H2O對成螺的麻醉時間短并且傷害小，可作為實驗用麻醉劑首選。以上研究結(jié)果為發(fā)展以銅銹環(huán)棱螺為模式生物開展環(huán)境(生態(tài))毒理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

銅銹環(huán)棱螺；模式生物；養(yǎng)殖條件；麻醉劑；優(yōu)化

當(dāng)前，隨著環(huán)境(生態(tài))毒理學(xué)的快速發(fā)展和科學(xué)需求，無脊椎軟體動物作為一種新興模式生物得到了前所未有的關(guān)注，并在水質(zhì)安全、沉積物質(zhì)量以及危險化學(xué)品毒性評估等研究中得到了應(yīng)用[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，軟體動物對污染物暴露表現(xiàn)出比脊椎動物(如魚類)更為敏感的特征，如淡水泥螺(Potamopyrgus antipodarum)比虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、鯉魚(Cyprinus carpio)和黑頭呆魚(Pimaphales promelas)等脊椎動物對內(nèi)分泌干擾物(如雌激素)以及污水處理廠出水產(chǎn)生更為明顯的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[3]，而河蚌(fatmucket, Lampsilis siliquoidea)對水環(huán)境中銅和氨氮表現(xiàn)出比現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)生物更高的靈敏度[4]，促使美國EPA對淡水水質(zhì)指標(biāo)中的氨氮標(biāo)準(zhǔn)做了修訂[5]。

銅銹環(huán)棱螺(Bellamya aeruginosa)，屬軟體動物門(mollusca)、腹足綱(gastropoda)、田螺科(viviparidae)，廣泛分布于我國的河流和湖泊中，在水生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著極其重要的作用[6]。同時，銅銹環(huán)棱螺為雌雄異體，卵胎生，易于飼養(yǎng)、個體規(guī)格適中、生長快、繁殖能力強(qiáng)，可作為一種潛在的淡水無脊椎模式生物開展生態(tài)毒理學(xué)研究[7]。近年，國內(nèi)以銅銹環(huán)棱螺作為實驗生物開展的毒理學(xué)研究逐漸增多[8-12]，這就要求能夠連續(xù)供應(yīng)高質(zhì)量的實驗生物，從而也對生物的室內(nèi)養(yǎng)殖條件提出了較高要求。然而，與斑馬魚和爪蟾等其它模式生物已有的室內(nèi)養(yǎng)殖規(guī)范和條件相比[13-14]，目前銅銹環(huán)棱螺室內(nèi)養(yǎng)殖并沒有成熟的養(yǎng)殖體系，不同實驗室根據(jù)自身條件來養(yǎng)殖所需的實驗生物，這就造成不同實驗室之間所取得的科學(xué)數(shù)據(jù)不具有可比性，從而嚴(yán)重限制了以銅銹環(huán)棱螺作為模式生物的科學(xué)發(fā)展。

本文以體重增長率為評判終點，分別從餌料、水深、底質(zhì)、密度和鈣離子角度方面對銅銹環(huán)棱螺的室內(nèi)養(yǎng)殖條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對不同麻醉劑的麻醉效果進(jìn)行了比較，研究結(jié)果為以銅銹環(huán)棱螺為模式生物開展生態(tài)毒理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用銅銹環(huán)棱螺(體重：1.72±0.48 g；殼高：29.4±2.4 mm)采于全國水產(chǎn)引育種中心(北京)池塘。將捕撈的實驗螺置于實驗室內(nèi)暫養(yǎng)3～5 d(24±0.5 ℃)，根據(jù)觸角的第二性特征區(qū)分雌雄(雌螺：左右兩只觸角等長并且直；雄螺：左側(cè)觸角彎曲并特化成雄性交接器(腹面觀))，每天投喂新鮮微綠球藻并更換部分充分曝氣的自來水，同時連續(xù)充氣以保證溶解氧水平。

1.2 室內(nèi)養(yǎng)殖因子優(yōu)化

隨機(jī)挑選活力強(qiáng)的實驗螺放入實驗缸，每組設(shè)置3個平行。實驗缸為一次成型玻璃缸(30×20×30 cm)，實驗用水為活性炭過濾并充分曝氣的自來水(鈣離子優(yōu)化實驗用水為去離子水)。在實驗前24 h注水備用，同時每個缸進(jìn)行連續(xù)充氣以保證溶解氧水平。所有養(yǎng)殖因子優(yōu)化條件均為水溫24±0.5 ℃，光周期為8(白):16(暗)。

實驗前和實驗2周后稱量每只螺體重，計算體重增長率。另外，在實驗結(jié)束后解剖實驗螺，計數(shù)子宮內(nèi)胚胎數(shù)量(分為有殼胚胎和無殼胚胎)。

1.2.1 餌料

將挑選的實驗螺隨機(jī)分組(10 只·組-1)，并分別以魚薄片餌料(粗蛋白：>40%；粗脂肪：>2.5%：粗纖維：(2～5)%；鈣：(0.9～2.0)%；磷：(0.8～1.4)%)(北京三元飼料)、淡水小球藻(C. vulgaris)(大連海洋大學(xué)水生生物實驗室提供)、雞蛋黃、玉米面和萵苣葉(市場購買)為實驗餌料，投喂量均為0.5 g·次-1，每天2次。實驗期間，每天換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.2.2 水深

將挑選的實驗螺隨機(jī)分組(10 只·組-1)，分別設(shè)置水深為5 cm、10 cm、15 cm和20 cm。每天投喂新鮮小球藻2次(0.5 g·次-1)，并換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.2.3 底質(zhì)

將挑選的實驗螺隨機(jī)分組(10 只·組-1)，分別以細(xì)沙、細(xì)土、碎石塊、玻璃(缸)作為底質(zhì)進(jìn)行比選。其中，細(xì)沙和細(xì)土使用前用前需過篩去除較大顆粒和其它雜質(zhì)，并徹底風(fēng)干后使用；碎石在高錳酸鉀溶液(0.1%)浸泡24 h并充分清洗后使用。鋪設(shè)時基質(zhì)厚5 cm，上面覆水10 cm。實驗期間，每天投喂新鮮小球藻2次(0.5 g·次-1)，每周換水1次，并更換基質(zhì)1次。其它條件同上。

1.2.4 密度

將挑選的實驗螺以10 個·組-1、20 個·組-1、30 個·組-1、40 個·組-1和60 個·組-1進(jìn)行隨機(jī)分組。每天投喂新鮮小球藻2次，分別為0.5 g·次-1、1.0 g·次-1、1.5 g·次-1、2.0 g·次-1、3.0 g·次-1。實驗期間每天換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.2.5 鈣離子(Ca2+)

將挑選的實驗螺隨機(jī)分組(10 只·組-1)，實驗用水用去離子水配置：123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O, 63.0 mg·L-1NaHCO3, 5.5 mg·L-1KCl。鈣離子濃度(CaCl2·2H2O)分別為0，10，30，100，300，500 mg·L-1。實驗期間每天換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.3 麻醉劑效果比較

麻醉是開展生物毒理學(xué)的必要手段，良好的麻醉效果是取得滿意結(jié)果的基本前提。因此，本文以5種常見麻醉劑為研究對象，初步篩選和比較了不同麻醉劑的麻醉效果,以期為今后開展相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。具體來講，實驗以MgCl2·2H2O(MgCl2)、丁香酚、酒精、鹽酸普魯卡因、間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)5種麻醉劑作為篩選藥品，其中MgCl2濃度設(shè)定為0、0.5、1、5、10和20 g·L-1，MS-222為0、5、10、30、100和300 mg·L-1，95%酒精濃度為0、0.5、1、3、5和10%(體積比)，丁香酚濃度為0、0.5、1、3、5、10 mg·L-1；鹽酸普魯卡因濃度為0、5、10、30、100和300 mg·L-1。

將挑選的實驗螺隨機(jī)分組(10 只·組-1)放入結(jié)晶皿中(?=18 cm)，加入1 L經(jīng)活性炭過濾并充分曝氣的自來水(24±0.5)℃，利用蠕動泵滴加麻醉劑至設(shè)置的終濃度(約2 h)，期間每隔10 min觀察1次。觀察時，用針頭輕輕刺激螺的腹足，若沒有反應(yīng)或反應(yīng)不靈敏，則判定螺處于麻醉狀態(tài)，記錄麻醉所需時間。2.5 h后，將處于麻醉狀態(tài)的螺移至清水中繼續(xù)觀察，每30 min觀察1次，觀察方法同上，記錄恢復(fù)螺數(shù)目與恢復(fù)時間。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，6.5 h后若有螺仍處于麻醉狀態(tài)(刺激沒有反應(yīng))，則認(rèn)為螺死亡。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各組所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±S.D)表示。對所得各組數(shù)據(jù)利用Origin 9.0軟件包的進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗各養(yǎng)殖條件的差異性，當(dāng)P<0.05時用Turkey進(jìn)行多重比較以檢驗實驗組間的差異性。對各組麻醉率采用非參數(shù)檢驗麻醉效果之間的差異性(SPSS 13.0)。

2 結(jié)果與討論(Results and Discussion)

2.1 餌料優(yōu)化

從圖1可以看出，投喂魚餌料組實驗螺體重增長率為(7.20±2.08)%，而其它各組的增長率相近(1.92%～2.89 %)，各組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 餌料對螺體重增長的影響Fig. 1 Bellamya aeruginosa body growth feeding with different foods

需要指出的是，魚餌料與小球藻投喂組實驗螺體重增長率的標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，而萵苣葉、雞蛋黃與玉米面組的偏差較大，說明魚餌料和小球藻投喂的效果最好，可作為室內(nèi)養(yǎng)殖螺的首選餌料，尤其是魚餌料是人工配合餌料，含有生物生長發(fā)育所需的各種營養(yǎng)元素包括粗蛋白、粗脂肪以及鈣和磷等元素。Eveland等[15]也發(fā)現(xiàn)投喂混合餌料的螺個體和繁殖能力均得到提高。然而，人工配合餌料中可能會含有一些促生長劑和增色劑等添加物，這對一些特定實驗?zāi)康难芯咳缃沂净瘜W(xué)品的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)就可能產(chǎn)生干擾，而小球藻作為天然產(chǎn)物(浮游植物)可作為首選餌料。

另外，從繁殖力(胚胎數(shù)量)來看，投喂不同餌料之間沒有顯著性差異(P>0.05)。然而，投喂小球藻和萵苣葉的實驗螺懷有的胚胎中，有殼胚胎數(shù)量多于無殼胚胎，而投喂其它餌料(魚餌料、雞蛋黃和玉米面)實驗螺懷有的無殼胚胎多于有殼胚胎，說明投喂小球藻和萵苣葉的植物性餌料有利于螺的胚胎發(fā)育。綜合來看，室內(nèi)養(yǎng)殖銅銹環(huán)棱螺的餌料應(yīng)以小球藻為最適餌料，期間可適當(dāng)輔以魚餌料進(jìn)行混合投喂。

2.2 水深優(yōu)化

由圖2可以看出，以15 cm水深組實驗螺的體重增長率最大，其次為10 cm水深組，而5 cm水深組的增長率最低，但不同水深組實驗螺體重增長率之間沒有明顯差異(P>0.05)，說明在室內(nèi)條件下，水深對實驗螺體重增長并不是一個主要因子。另外，從各組體重增長率的標(biāo)準(zhǔn)偏差來看，5 cm和20 cm水深組實驗螺個體間的差異較大，暗示養(yǎng)殖水過深或過淺可能均不利于螺生長。考慮到螺生長的水環(huán)境質(zhì)量和空間需要，室內(nèi)養(yǎng)殖的水深最好控制在10 ～ 15 cm為好。

2.3 底質(zhì)優(yōu)化

由圖3可以看出，細(xì)土底質(zhì)組實驗螺體重增長率最高，并且顯著高于玻璃底質(zhì)(P<0.05，Turkeytest)，但與細(xì)沙和碎石塊組之間沒有顯著性差異(P>0.05)，這可能是由于土質(zhì)中含有大量有機(jī)質(zhì)而促進(jìn)螺的生長。在自然環(huán)境中，螺可以棲息在泥質(zhì)中，并經(jīng)常吸附在石塊、木質(zhì)等固體附著物上，而沙質(zhì)則不利于螺的生長，這與實驗室結(jié)果相近。然而，在實驗室條件下，長時間的泥質(zhì)容易變質(zhì)而不利于螺生長，這就需要定期更換泥質(zhì)以保持適于螺的生長環(huán)境。當(dāng)然，由于螺的棲息環(huán)境不同，因此對底質(zhì)的要求也就不同，本文銅銹環(huán)棱螺以泥土底質(zhì)生長最好，而Bulinus nyassanus則在沙底質(zhì)的環(huán)境生長最好[16]，這可能與不同螺在自然界中所處的自然棲息環(huán)境有關(guān)。因此，底質(zhì)的選擇要根據(jù)目標(biāo)生物在自然環(huán)境中的棲息環(huán)境并結(jié)合室內(nèi)優(yōu)化結(jié)果做出合適的選擇。

2.4 密度優(yōu)化

從圖4可以看出，隨著養(yǎng)殖密度增大，實驗螺體重增長率呈先增加(從2 個·L-1到6個·L-1)、后降低(從6 個·L-1到12 個·L-1)趨勢，并且6 個·L-1組實驗螺體重增長率顯著高于其它各組(P<0.05)。這個密度明顯高于Biomphalaria glabrata室內(nèi)養(yǎng)殖的密度要求(2 ～ 50 個·L-1)[17]。對于前期隨密度增大體重增長率增加，可能是由于個體間存在著一定的協(xié)同效應(yīng)，從而相互促進(jìn)增長；而后期隨著密度增大體重增長率降低，可能是由于密度增加導(dǎo)致單位空間個體間競爭，從而導(dǎo)致體重增加減慢。并且，如果是靜水養(yǎng)殖，隨著單位密度增大，可能會導(dǎo)致水環(huán)境溶解氧水平降低，如高密度螺在靜水中養(yǎng)殖4 d后，水體中溶解氧水平明顯低于正常養(yǎng)殖密度水體內(nèi)的溶解氧水平[18]。以上結(jié)果說明，螺的室內(nèi)養(yǎng)殖會存在密度因子限制，這對開展室內(nèi)相對小空間范圍內(nèi)的養(yǎng)殖系統(tǒng)提出了要求。

圖2 水深對螺體重增長的影響Fig. 2 Bellamya aeruginosa body growth at different water depths

圖3 底質(zhì)對螺體重增長的影響Fig. 3 Bellamya aeruginosa body growth at different sediments

圖4 密度對螺體重增長的影響Fig. 4 Bellamya aeruginosa body growth at different densities

2.5 Ca2+優(yōu)化

從圖5可以看出，螺體重增長率隨著鈣離子濃度增加呈先增加(0到30 mg·L-1)、后降低(30到500 mg·L-1)的趨勢，并在30 mg·L-1時體重增長率達(dá)到最高。另外，10, 30, 100 mg·L-1組與0 mg·L-1組螺體重增長率均具有顯著性差異(P<0.05)，說明鈣離子對螺生長發(fā)育具有重要作用。如當(dāng)環(huán)境中鈣離子水平低于2 mg·L-1時，螺個體就會明顯減小并且螺殼容易產(chǎn)生畸形[19]。當(dāng)水環(huán)境中鈣離子濃度高于300 mg·L-1甚至達(dá)到500 mg·L-1時，螺體重增長率反而降低，并且明顯低于30 mg·L-1組(P<0.05)，說明鈣離子濃度過高時可能會對螺產(chǎn)生毒害作用，從而抑制了體重的增長，這與Mishkin and Jokinen結(jié)果一致[15]。以上結(jié)果說明，水體中鈣離子濃度處于30 mg·L-1時最為適合螺的生長發(fā)育，這與Biomphalaria glabrata (say)對環(huán)境鈣水平的要求相似[15]。這明顯低于我國生活飲用水中硬度標(biāo)準(zhǔn)(硬度(CaCO3)：450 mg·L-1；折合鈣離子：180 mg·L-1)(GB 5749-2006)，這就要求在螺的室內(nèi)養(yǎng)殖中，需要對鈣離子進(jìn)行適當(dāng)控制。

2.6 麻醉劑優(yōu)化

麻醉劑對螺的麻醉效果見圖6。從麻醉時間來看，在30 min后MgCl2各組均產(chǎn)生一定的麻醉效果，其中10 和20 g·L-1組的麻醉率超過了50%，并且顯著高于0.5 g·L-1組(P<0.05)，在150 min后達(dá)到了80%，而20 g·L-1組則為100%(圖6-(a))。而從恢復(fù)效果來看，只有低濃度(0.5, 1 和5 g·L-1)組能夠全部恢復(fù)活力(4.5～6.5 h)，而高濃度組(10和20 g·L-1)的恢復(fù)率分別只有66.67%和40%(6.5 h)。對于其它麻醉劑(圖6-(b)、(c)、(d)和(e))，只有10%乙醇濃度組和300 mg·L-1的鹽酸普魯卡因在30 min時產(chǎn)生了較弱的麻醉作用(10%～20%)，其它各組的麻醉率直到90 min后超過50%。從恢復(fù)效果來看，乙醇組的恢復(fù)效果最好，低濃度組(0.5%，1%和3%)在6.5 h后恢復(fù)率均到達(dá)了100%，高濃度組(5%和10 %)的恢復(fù)率也超過了50%。另外，高濃度乙醇(5%和10%)的麻醉率顯著高于低濃度(0.5%)(P<0.05)，同樣，高濃度丁香酚(10 mg·L-1)的麻醉率也顯著高于低濃度(0.5 mg·L-1)的麻醉率(P<0.05)。而丁香酚、鹽酸普魯卡因和MS-222在6.5 h后只有最低濃度組的恢復(fù)率達(dá)到了100%，其它各組只有50%左右甚至更低，并且各處理組之間的麻醉率的差異不顯著(P>0.05)。綜上所述，MgCl2(5～10 g·L-1)對螺的麻醉效果最好，其次為乙醇，其余3種則沒有明顯區(qū)別。

綜上所述，在室內(nèi)養(yǎng)殖模式下，以泥土底質(zhì)、密度為6 個·L-1、水深10～15 cm、水體鈣離子濃度為30 mg·L-1，并投喂小球藻可作為銅銹環(huán)棱螺的適宜養(yǎng)殖條件；在生物麻醉處理時，MgCl2可作為實驗處理的首選藥劑。

圖5 鈣離子對體重增長的影響Fig. 5 Bellamya aeruginosa body growth at different calcium ion levels

圖6 麻醉劑對螺的麻醉效果Fig. 6 Effects of different anesthetics for Bellamya aeruginosa

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A Study of the Laboratory Conditions ofBellamyaaeruginosa

Qiang Fan1,2, Bingchun Tao1, Bo Wang2, Zeyan Zhang2, Rui Zeng2, An Lihui2,*

1. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China 2. State Environmental Protection Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China

Received 17 October 2014 accepted 29 November 2014

Bellamya aeruginosa could be used as a potential ecotoxicological model organism; however, the first requirement for future research is to optimize laboratory conditions. The present study optimized food, water depth, bottom materials, density, and calcium ion concentration for Bellamya aeruginosa cultured under artificial conditions using weight gain ratio as the endpoint, and then followed by evaluation of different anesthetics including MgCl2·2H2O, ethanol, eugenol, procaine hydrochloride and MS-222. Results indicated that growth was optimal with the following conditions: feeding fresh C. vulgaris, culturing at a density of 6 number·L-1, keeping the water depth at 10 ～ 15 cm, using fine soil as the bottom material and keeping the calcium ion concentration at 30 mg·L-1. Furthermore, results showed that MgCl2·2H2O should be the primary choice of anesthetic for this organism. These conditions will result in proper rearing and maintenance of Bellamya aeruginosa for use as a model organism in future.

Bellamya aeruginosa; model organism; culture condition; anesthetic; optimization

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2013ZX07501005)；國家自然科學(xué)基金項目(21177117)

范強(qiáng)(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為水生毒理學(xué)，E-mail: s0804014121@126.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: anlhui@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20141017002

2014-10-17 錄用日期：2014-11-29

1673-5897(2015)3-200-09

X171.5

A

安立會(1975-)，男，環(huán)境科學(xué)博士，副研究員，主要研究方向為生態(tài)毒理學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文30余篇。

范強(qiáng)，陶秉春，王博, 等. 銅銹環(huán)棱螺室內(nèi)實驗條件優(yōu)化[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(3): 200-208

Fan Q, Tao B C, Wang B, et al. A study of the laboratory conditions of Bellamya aeruginosa [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 200-208 (in Chinese)