張明軒，李穎邦，劉愛云，張學(xué)文

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128

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Cd2+對(duì)BY-2細(xì)胞的毒性機(jī)制及水楊酸的緩解作用

張明軒，李穎邦，劉愛云，張學(xué)文*

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128

鎘對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害表現(xiàn)出對(duì)植物這種定生生物的毒害性。以綠色熒光蛋白(GFP)膜泡標(biāo)記的煙草BY-2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，分別在熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察了Cd2+對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用和機(jī)制，并研究了水楊酸(SA)處理對(duì)Cd2+植物細(xì)胞毒害的緩解作用。研究發(fā)現(xiàn)激光共聚焦顯微鏡可以觀察到Cd2+處理3 h后細(xì)胞熒光亮度減弱，6 h時(shí)細(xì)胞皺縮和液泡縮小，9 h細(xì)胞大多死亡。在Cd2+脅迫同時(shí)加入SA，可顯著提高細(xì)胞成活時(shí)間，熒光亮度增強(qiáng)、液泡化程度加大，同時(shí)能夠觀察到熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜包裹Cd2+的高熒光顆粒。SA處理的細(xì)胞還通過高度液泡化來緩解重金屬Cd2+的毒性。結(jié)果表明具有生物活性的SA誘導(dǎo)細(xì)胞的液泡化，并通過膜成分對(duì)重金屬的包裹和結(jié)合進(jìn)一步降低了重金屬對(duì)植物細(xì)胞的毒害。因此水楊酸緩解重金屬對(duì)植物細(xì)胞的毒性，是通過誘導(dǎo)細(xì)胞的液泡化和膜對(duì)重金屬離子的包裹束縛而實(shí)現(xiàn)的。

鎘；水楊酸；熒光標(biāo)記BY-2細(xì)胞；聯(lián)合作用

隨著工農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展，工業(yè)污水和廢渣繼續(xù)排放，化肥的大量使用，造成我國土壤和水源的重金屬污染加劇[1]。過量的重金屬會(huì)對(duì)植物有毒害作用，并且通過食物鏈和生物富集作用，最終會(huì)危害到人體健康，帶來一系列的社會(huì)問題[2-3]。重金屬污染問題已經(jīng)日益受到人們的重視，植物對(duì)重金屬脅迫抵御機(jī)制的研究也在日益深入。重金屬在植物體內(nèi)會(huì)不斷累積，當(dāng)累積超過一定的閥值之后，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，并最終影響到植株體的正常生理活動(dòng)[4]。為應(yīng)對(duì)重金屬脅迫帶來的損傷，植物進(jìn)化出獨(dú)特的防御機(jī)制，如通過提升一些保護(hù)酶的活性、激素含量水平的變化等措施來降低受到的傷害[5]。水楊酸(salicylic acid，SA)是一種酚類化合物，普遍存在于植物體內(nèi)，其化學(xué)名稱為鄰羥基苯甲酸[6]。由于SA存在增強(qiáng)植物在熱脅迫、鹽害、低溫、干旱、等非生物脅迫條件下清除活性氧的能力，降低細(xì)胞受到的氧化損傷[7]。SA被認(rèn)為是研究植物抵御脅迫的信號(hào)分子，因此研究水楊酸對(duì)Cd2+脅迫下細(xì)胞的影響，可以從細(xì)胞水平上揭示水楊酸對(duì)植物細(xì)胞抗重金屬脅迫的機(jī)制，對(duì)其應(yīng)用于植物防御重金屬毒性有著重要意義。結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，植物受重金屬脅迫后，在其細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的改變是植物一系列生理活動(dòng)異常的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。為了開展這項(xiàng)研究，我們利用煙草膜泡運(yùn)輸特征蛋白SCAMP2[8]與綠色熒光蛋白GFP進(jìn)行基因重組并轉(zhuǎn)化植物模式細(xì)胞——煙草BY2細(xì)胞，獲得了膜泡熒光標(biāo)記的BY2細(xì)胞。煙草BY2細(xì)胞作為一種模式植懸浮培養(yǎng)細(xì)胞開展的研究，具有均一性好、條件容易控制、培養(yǎng)周期短、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[9]，而用其進(jìn)行重金屬鹽毒性的研究，可以直接從細(xì)胞水平來研究重金屬鹽對(duì)細(xì)胞的作用，避開了植株水平根吸收及輸運(yùn)過程的影響。

1 材料和方法(Naterials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SCAMP2-GFP膜泡熒光標(biāo)記的BY-2細(xì)胞由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將離心收集的BY-2細(xì)胞懸浮于MS培養(yǎng)基A中；將等量的BY-2細(xì)胞懸浮于含有0.068 mmol·L-1CdCl2的MS培養(yǎng)基B中(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明0.068 mmol·L-1為BY-2細(xì)胞在試驗(yàn)周期中的半致死濃度)；將等量的BY-2細(xì)胞懸浮于含有0.068 mmol·L-1CdCl2與0.1 mmol·L-1SA的MS培養(yǎng)基C中(如表1)。把處理A、B和C同時(shí)置于120 r·min-1、26 ℃中培養(yǎng)，在3 h、6 h、9 h分別取樣進(jìn)行細(xì)胞熒光觀察(10×20)。以及分別取出培養(yǎng)6 h的樣品進(jìn)行激光共聚焦觀察(Confocal laser scanning microscope FV1000)。用移液器吸取少許細(xì)胞，滴在載玻片上，再用去離子水稀釋，利用移液器槍頭將細(xì)胞充分打散，再加蓋玻片后，顯微鏡下觀察照相。

2 結(jié)果與分析(Results and anslysis)

細(xì)胞熒光觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)BY-2細(xì)胞培養(yǎng)至3 h的時(shí)候，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)照組A和Cd-SA處理組C中細(xì)胞超微機(jī)構(gòu)無明顯破壞，大多數(shù)細(xì)胞處于分裂前、中期；而Cd處理組B中少數(shù)細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，核仁散開，核膜破裂，染色質(zhì)從核孔散出，細(xì)胞皺縮和液泡縮小并出現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的癥狀(圖1)。當(dāng)BY-2細(xì)胞培養(yǎng)到6 h的時(shí)候，處理A、C中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)依然沒有明顯破壞，大多數(shù)細(xì)胞仍然處于分裂前、中期；而處理B中多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞壞死狀態(tài)，其膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，最后細(xì)胞破裂(圖2)。當(dāng)BY-2細(xì)胞培養(yǎng)到9 h的時(shí)候，處理A中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)仍然沒有明顯破壞，細(xì)胞生長狀態(tài)良好；處理C中有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞核染色質(zhì)凝集，核仁散開等細(xì)胞死亡的癥狀，但仍然有不少處于正常分裂期的細(xì)胞；而處理B中極大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)完全裂解，細(xì)胞開始分散，細(xì)胞間的黏附度下降，細(xì)胞呈現(xiàn)出不正常的生長狀態(tài)，在顯微鏡下只能看到少量分散熒光或者已經(jīng)看不到任何熒光(圖3)。由圖4可知，處理B細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，在9 h處存活率最低，下降幅度是最大的；培養(yǎng)基C細(xì)胞存活率下降度比培養(yǎng)基B細(xì)胞要低，并且在9 h處理C細(xì)胞存活率明顯要高于處理B細(xì)胞。

表1 細(xì)胞處理的配組

注：+為加入該物質(zhì)處理，-為未加入該物質(zhì)處理。

Note: + treatment; - without treatment.

圖1 熒光標(biāo)記BY-2培養(yǎng)3 h處理后細(xì)胞形態(tài)Fig. 1 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 3 h treatment

圖2 熒光標(biāo)記BY-2培養(yǎng)6 h處理后細(xì)胞形態(tài)Fig. 2 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 6 h treatment

細(xì)胞激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)BY-2細(xì)胞培養(yǎng)到6 h的時(shí)候?qū)φ誂中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)無明顯變化，質(zhì)膜完整，細(xì)胞正常生長，形態(tài)良好；處理B中細(xì)胞出現(xiàn)和熒光顯微鏡觀察下相同的情況：大部分細(xì)胞體積異常增大，細(xì)胞分散腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，細(xì)胞質(zhì)膜破碎，細(xì)胞呈現(xiàn)出壞死狀態(tài)；處理C中大部分細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無明顯變化，細(xì)胞體積正常，生長狀態(tài)良好，部分細(xì)胞高度液泡化，并且在細(xì)胞質(zhì)膜上出現(xiàn)了明顯的熒光亮點(diǎn)。

圖3 熒光標(biāo)記BY-2培養(yǎng)9 h處理后細(xì)胞形態(tài)Fig. 3 The cell morphology of the GFP labeled BY-2 after 9 h treatment

圖4 熒光標(biāo)記BY-2水楊酸和Cd2+處理時(shí)間與細(xì)胞存活率柱形圖Fig. 4 The BY-2 survival chart after treatment of SA and Cd2+

3 討論(Discussion)

利用煙草膜泡綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記的BY-2細(xì)胞，結(jié)合當(dāng)細(xì)胞受到重金屬Cd2+影響后在膜泡上熒光強(qiáng)度的大小，在單細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上，研究外源SA在細(xì)胞水平與植物鎘耐性的相關(guān)性，可以很明顯的得出細(xì)胞熒光強(qiáng)度越強(qiáng)鎘的耐受性越大。

圖5 BY-2培養(yǎng)6 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察到熒光集中點(diǎn)Fig. 5 The fluorescence enclose are observed around the BY-2 membrane after 6 h SA-Cd treatmen t of the cell under the CLSM

通過對(duì)圖1、2、3分析發(fā)現(xiàn)，在重金屬Cd2+處理3 h，與對(duì)照組A相比較，水楊酸存在時(shí)鎘處理的Cd-SAC組中大部分細(xì)胞呈現(xiàn)出高度的液泡化，體積膨大明顯，并且絕大部分的細(xì)胞熒光亮度達(dá)到了最大值；而Cd處理的B組中大部分細(xì)胞除了體積膨大外也已呈現(xiàn)出皺縮的現(xiàn)象。在重金屬處理的6 h處，Cd-SA處理組大部分細(xì)胞仍保持體積膨大的狀態(tài)，且少部分細(xì)胞熒光亮度沒有減弱；而Cd處理的B組細(xì)胞則熒光亮度減弱，細(xì)胞皺縮現(xiàn)象加劇。在9 h處，Cd處理的B組細(xì)胞亮度降到了最低值，絕大部分細(xì)胞已皺縮死亡；Cd-SA處理的C組仍有部分細(xì)胞保持較大的體積和較強(qiáng)的熒光亮度。推測原因，細(xì)胞以高度液泡化的形式來抵御重金屬帶來的損傷。細(xì)胞通過高度液泡化來緩解重金屬的毒害作用，這與李春燁等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，所以細(xì)胞體積膨大；另外，由于在外源SA的影響下，Cd-SA處理的C組細(xì)胞SCAMP2膜泡運(yùn)輸?shù)鞍讛?shù)量增加，加大了對(duì)重金屬Cd2+的運(yùn)輸，大大提高了熒光亮度和降低了重金屬的毒害作用，細(xì)胞死亡率有所降低。

通過圖4發(fā)現(xiàn)，在重金屬Cd2+脅迫6 h時(shí)，與對(duì)照組培養(yǎng)基A相比較，Cd-SA處理的C細(xì)胞呈現(xiàn)出更高程度的液泡化，并且只有Cd-SA處理的C組細(xì)胞膜上出現(xiàn)了高熒光顆粒(如圖5中箭頭方向所示)，與高電子密度顆粒一致，Liu和Kottkel[11]證實(shí)這些高電子密度顆粒中含有Cd2+。這說明細(xì)胞質(zhì)中游離的Cd2+以細(xì)胞質(zhì)膜包裹的形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到了減少胞外Cd2+的數(shù)量和降低對(duì)細(xì)胞帶來的傷害。另外，由圖4我們也可以發(fā)現(xiàn)，已有高熒光顆粒開始脫離細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，說明在細(xì)胞質(zhì)膜處形成了凹陷，Cd2+離子將會(huì)被膜泡包裹，然后脫離質(zhì)膜，將重金屬隔離在特定部位，以減少破壞作用[12,13]。宇克莉等[14]證明，細(xì)胞液泡內(nèi)含有各種的蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)，能夠有效地與重金屬結(jié)合，并且液泡膜上存在轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬的H-ATP酶和Ca-ATP酶，從而降低重金屬的毒害作用。一般情況下，植物對(duì)于低濃度的重金屬脅迫通過其細(xì)胞壁的固定作用、質(zhì)膜的選擇透過性和液泡的區(qū)室化作用可以產(chǎn)生一定的抵御能力。在重金屬脅迫下，細(xì)胞內(nèi)部會(huì)形成數(shù)量不等的囊泡，包裹有重金屬的囊泡將會(huì)與液泡相融合，達(dá)到重金屬解毒的效果[15-16]。

SA作為一種小分子酚類化合物，在植物受到生物或非生物脅迫時(shí)，其生物活性會(huì)被激活，在抵御生物和非生物脅迫帶來的傷害。在受到重金屬脅迫后，植物內(nèi)源SA水平升高，抗氧化系統(tǒng)酶類活性升高，熱激蛋白、PRP、RP、幾丁質(zhì)酶等蛋白等防御基因表達(dá)活性提高，植物對(duì)重金屬脅迫的抵御能力提高[17]。通過施加外源SA有助于緩解重金屬的毒害作用，提高對(duì)非生物脅迫的抗性[18-20]。李豐濤[21]在研究鎘對(duì)紅麻根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響中發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的Cd脅迫處理下，紅麻的根系活力明顯降低，根膜透性也有一定的上升，Cd對(duì)紅麻根系確實(shí)造成了損傷。另外還發(fā)現(xiàn)，在施加了外源的GSH且在較低濃度Cd脅迫時(shí),細(xì)胞壁和細(xì)胞膜出現(xiàn)黑色沉積，Cd離子被阻隔在了原生質(zhì)之外，保護(hù)了細(xì)胞。在本研究中同樣也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。在Cd2+處理后，BY-2細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離和原生質(zhì)膜破裂現(xiàn)象，并且細(xì)胞器出現(xiàn)逐漸減少的現(xiàn)象，核膜、核仁解體而游離在胞質(zhì)中。在進(jìn)行Cd-SA處理后，細(xì)胞質(zhì)膜周圍出現(xiàn)了包裹著重金屬離子的高電子密度顆粒，且細(xì)胞的存活率也較高，說明在外源SA的影響下，BY-2細(xì)胞內(nèi)的重金屬Cd2+得到了有效的生物處理，減緩了這些超微結(jié)構(gòu)的改變給細(xì)胞造成的不可逆的損傷。本研究得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李豐濤在研究中施加外源GSH來緩解Cd對(duì)紅麻根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)毒害作用的結(jié)果較為相似，為本研究中采用施加外源SA的研究方法提供了一定的知道思路。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，在重金屬Cd2+脅迫下，Cd-SA處理的細(xì)胞存活率較高，并由于其SCAMP2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高生物活性，獲得了較高熒光亮度，并且在質(zhì)膜處也發(fā)現(xiàn)了高電子密度顆粒，說明外源SA在協(xié)助細(xì)胞抵御重金屬脅迫中是有一定的促進(jìn)效果的。

致謝：感謝植物激素及生長發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供和協(xié)助進(jìn)行掃描激光共聚焦觀察。

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Cadmium Toxicology to Cultured BY-2 Cells and the Relief Effects of Salicylic Acid to the Cadmium Toxicity

Zhang Mingxuan, Li Yingbang, Liu Aiyun, Zhang Xuewen*

College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

Received 30 October 2014 accepted 27 November 2014

The toxicity to immobilized plants is one of the most harmful effects of heavy mental cadmium to the ecological environment. In this paper the toxicity and mechanism of Cd2+to plants cells were analyzed by fluorescence microscope and confocal laser scanning microscope observation in GFP membrane labeled BY-2 cell. The relief effects of salicylic acid (SA) treatment to the Cd2+toxicity were also investigated. The results showed that the GFP fluorescence of the labeled cells was getting dimming after 3 h Cd2+treatment. The cells and vacuoles were apparently shrunk after 6 h. All the cells were dead after 9 h treatment. When SA was also added during the Cd2+treatment, the survival time of the treated cells were prolonged significantly. The SA and Cd2+treated cells also showed stronger fluorescence and better vacuolization compared to the Cd2+treatment. High fluorescence particles attached to the cell membrane were observed, indicating that there were wrapped Cd2+microcapsules formed in SA treatment cells. The results suggest that the SA treatment can relieve the toxicity of heavy metals both by high vacuolization in the cells and by membrane components retention of the heavy metals ion. The conclusion is that the microcapsule retention and vacuolization of the cells induced by SA is the mechanism of the SA toxicity relief.

cadmium; salicylic acid; GFP membrane labeled BY-2 cell; combined effect

湖南省教育廳一般項(xiàng)目(12C0156)

張明軒 (1989-), 男, 碩士研究生, 研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)胞生物學(xué), E-mail: 18684851879@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xwzhang@hunau.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20141030001

2014-10-30 錄用日期：2014-11-27

1673-5897(2015)3-224-06

Q247

A

張學(xué)文(1965-)，男，植物學(xué)博士，教授，主要從事細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)與研究，發(fā)表論文50余篇。

張明軒, 李穎邦, 劉愛云, 等. Cd2+對(duì)BY-2細(xì)胞的毒性機(jī)制及水楊酸的緩解作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(3): 224-229

Zhang M X, Li Y B, Liu A Y, et al. Cadmium toxicology to cultured BY-2 Cells and the relief effects of salicylic acid to the cadmium toxicity [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 224-229 (in Chinese)