楊安倫，陳 忠，李建生

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響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)選金蟬花麥角甾醇提取工藝

楊安倫1*，陳 忠2，李建生3

目的 優(yōu)選金蟬花中麥角甾醇的最佳提取工藝。方法 選擇乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間為自變量，麥角甾醇提取量為因變量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝，通過Design- Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性模型和二次多項(xiàng)式模型擬合，并繪制效應(yīng)面圖和等高線圖。結(jié)果 金蟬花中麥角甾醇的最佳提取工藝為以88%乙醇為提取溶劑，在74 ℃下提取38 min；麥角甾醇檢測濃度在9.28～148.50 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為97.99%。結(jié)論 優(yōu)化的條件簡單、快速，可為金蟬花的進(jìn)一步開發(fā)利用和有效性研究提供理論依據(jù)。

金蟬花；麥角甾醇；提取工藝；HPLC；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法

0 引言

金蟬花[1](Cordyceps cicadae)又名蟬花、蟬茸、蟲花、蟬蟲草、蟬茸菌，為麥角菌科真菌大蟬草(Cordyceps cicadae Shing)寄生于蟬科昆蟲的若蟲上形成的蟲菌復(fù)合體，其性味甘寒，具散風(fēng)熱、定驚鎮(zhèn)痙、明目之功效，屬于蟲草類藥材。金蟬花含有豐富的生物活性成分，如多糖[2]、多種生物堿、D-甘露醇[3]、蟲草酸、核苷類成分[4-5]、多種必需氨基酸[6]等有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，金蟬花具有抗衰竭[7]、降血糖[8]、改善貧血、調(diào)解免疫功能[9]、耐缺氧、延長壽命、促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力等作用。

麥角甾醇是真菌類特征甾醇[10]，是一種重要的維生素D源。具有調(diào)節(jié)真菌細(xì)胞膜流動性的功能，確保細(xì)胞活力及物質(zhì)運(yùn)輸[11]，同時(shí)在抗腫瘤方面也發(fā)揮重要的作用[12]。本試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選金蟬花麥角甾醇的提取工藝，以麥角甾醇提取量為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.0.6軟件分析，優(yōu)化提取溶劑乙醇的濃度，提取時(shí)間和提取溫度。并通過適用性考察，確定HPLC檢測的最佳色譜條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀，配置包括四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱、DAD檢測器，變色龍色譜數(shù)據(jù)工作站；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；梅特勒XS-105電子分析天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland)；KS-80中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；R-201恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)。

1.2 試藥 金蟬花(批號：20140501，產(chǎn)地：浙江)購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司；麥角甾醇對照品(批號：111845-201102，含量97.7%)購自中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇為分析純，流動相甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

2 金蟬花麥角甾醇提取方法考察

2.1 提取溶劑的選擇 稱取金蟬花粉末(過三號篩)約0.25 g，精密加入溶劑、水及20%、40%、60%、80%乙醇溶液和無水乙醇各50 mL，在80 ℃水浴鍋中提取45 min，冷卻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量分析。如圖1可知，溶劑對金蟬花麥角甾醇提取有較大影響，其中水、20%和40%乙醇溶液提取未檢測出麥角甾醇成分，而80%乙醇對麥角甾醇提取有最佳效果。

圖1 乙醇濃度對金蟬花麥角甾醇提取量的影響

2.2 提取溫度的選擇 稱取金蟬花粉末約0.25 g，精密加入80%乙醇溶液50 mL，50、60、70、80、90、100 ℃水浴鍋中提取45 min，冷卻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量分析。如圖2可知，80 ℃條件下金蟬花麥角甾醇提取效果最佳。

圖2 提取溫度對金蟬花麥角甾醇提取量的影響

2.3 提取時(shí)間的選擇 稱取金蟬花粉末約0.25 g，精密加入80%乙醇溶液50 mL，在80 ℃水浴鍋中分別提取15、30、45、60、75、90 min，冷卻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量分析。如圖3可知，提取時(shí)間為30 min麥角甾醇提取效果最佳。

2.4 料液比的選擇 稱取金蟬花粉末約0.25 g，以料液比1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300 (g∶mL)精密加入相應(yīng)體積的80%乙醇溶液，在80 ℃水浴鍋中提取30 min，冷卻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量分析。麥角甾醇含量依次為0.323、0.481、0.544、0.691、0.682、0.698 mg/g，由結(jié)果可知在料液比1∶200之后，隨著料液比的增加，提取效果無明顯改善，故實(shí)驗(yàn)以料液比1∶200進(jìn)行提取。

圖3 提取時(shí)間對金蟬花麥角甾醇提取量的影響

2.5 提取工藝的優(yōu)化

2.5.1 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間為考察因素進(jìn)行星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因料液比為非連續(xù)變量，確定料液比為1∶200 (g∶mL)，以麥角甾醇提取量為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，因素水平見表1，試驗(yàn)安排與結(jié)果見表2。

表1 金蟬花麥角甾醇提取工藝星點(diǎn)因素水平

表2 金蟬花麥角甾醇提取工藝星點(diǎn)試驗(yàn)安排

2.5.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn) 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元擬合，得到乙醇濃度(X1)、提取溫度(X2)、提取時(shí)間(X3)與金蟬花麥角甾醇提取量之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=680.406+63.747 5 X1-3.298 75 X2+14.858 75 X3+1.265 X1X2+0.485 X1X3-16.442 5 X2X3-81.576 75 X12-10.059 25 X22-23.634 25 X32(R2=98.53%)。

從表3可以看出，因素中一次項(xiàng)提取時(shí)間對金蟬花麥角甾醇提取量具有顯著性差異，乙醇濃度對金蟬花麥角甾醇提取量具有極顯著差異，提取溫度對金蟬花麥角甾醇提取量線性效應(yīng)不顯著；二次項(xiàng)中乙醇濃度對金蟬花麥角甾醇提取量的曲面效應(yīng)極顯著；比較各因子交互作用均不顯著。

2.5.3 響應(yīng)面分析 Design-Expert 8.0.6 軟件依據(jù)回歸方程來繪制響應(yīng)面立體分析圖及等高線，考察所擬合的響應(yīng)面曲線的形狀，并通過響應(yīng)面等高線圖(圖4)和曲面圖(圖5)對影響金蟬花麥角甾醇提取量的條件中任何2種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)和分析，從而確定最佳工藝。

表3 回歸模型方差分析

圖4 優(yōu)化工藝模型的等高線疊加圖

3.提取溫度與提取時(shí)間對麥角甾醇提取量影響的等高線疊加圖

圖5 優(yōu)化工藝模型的效應(yīng)面圖

3.提取溫度與提取時(shí)間對麥角甾醇提取量影響的效應(yīng)面圖

2.5.4 工藝參數(shù)的優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由簡化的回歸方程進(jìn)行預(yù)測分析，在星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，最優(yōu)試驗(yàn)條件為：乙醇濃度87.76%、提取溫度74.44 ℃、料液比1∶200(g∶mL)、提取時(shí)間37.67 min，金蟬花麥角甾醇提取量的預(yù)測值為697.50 μg/g。

稱取金蟬花粉末約0.25 g，共3份，分別精密加入88%乙醇溶液50 mL，在74 ℃水浴鍋中提取38 min，冷卻，過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行含量分析。得金蟬花麥角甾醇提取量分別為693.64、688.97、696.51 μg/g，平均值為693.04 μg/g，RSD=0.55%，與預(yù)測值接近，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝合理可行。

3 麥角甾醇的HPLC測定

3.1 波長的選擇 用UltiMate 3000 DAD對麥角甾醇在200～600 nm處進(jìn)行掃描。麥角甾醇在283 nm處有最大吸收值，故選用283 nm作為檢測波長。

3.2 色譜條件 以Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱，以甲醇為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測波長為283 nm，進(jìn)樣量為10 μL[13]。色譜圖見圖6。

圖6 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(1)及金蟬花樣品(2)HPLC色譜圖

3.3 對照品溶液的制備 精密稱取麥角甾醇對照品3.8 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為儲備液。根據(jù)要求，用甲醇將儲備液稀釋成9.28、18.56、37.13、74.25、148.50 μg/mL系列溶液，作為對照品溶液。

3.4 線性關(guān)系考察 按“3.2”項(xiàng)下色譜條件，依次吸取麥角甾醇系列對照品溶液各10 μL，注入色譜儀測定，以麥角甾醇吸收峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X,μg/mL)進(jìn)行線形回歸，得回歸方程：Y=0.149 7 X-0.190 4，R2=0.999 8，結(jié)果顯示，進(jìn)樣量在9.28～148.50 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3.5 精密度考察 以37.13 μg/mL麥角甾醇對照品溶液為測試溶液，對精密度進(jìn)行考察。按“3.2”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果RSD為0.95%(n=6)，結(jié)果表明，此條件下麥角甾醇的精密度和重現(xiàn)性良好。

3.6 穩(wěn)定性考察 稱取金蟬花粉末約0.25 g，按“2.5.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，過濾，取續(xù)濾液，分別在0、5、10、15、20、25、30 h進(jìn)行測定，得峰面積，其RSD值為1.17%，結(jié)果表明，在30 h內(nèi)樣品穩(wěn)定。

3.7 準(zhǔn)確度考察 稱取已知含量的金蟬花粉末6份，每份約0.25 g，加入適量麥角甾醇對照品，按“2.5.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取制備，金蟬花對照品溶液和供試品溶液各進(jìn)樣10 μL，測得峰面積并計(jì)算含量，得平均回收率為97.99%，RSD=0.69% (n=6)。

3.8 樣品測定及重復(fù)性考察 精密稱取同一批號金蟬花粉6份，每份約0.25 g，按“2.5.4”項(xiàng)下優(yōu)化方法進(jìn)行提取，測定峰面積，并計(jì)算麥角甾醇含量(μg/g)，平均值為700.25 μg/g，RSD為0.88%。

4 結(jié)論

4.1 提取方法的選擇 本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度作為考察因素，麥角甾醇提取量為評價(jià)指標(biāo)，以Design-Expert 8.0.6為分析軟件，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)篩選出在1∶200 (g∶mL)料液比下，以88%乙醇溶液為提取溶劑，74 ℃水浴提取38 min，金蟬花麥角甾醇最高提取量為693.04 μg/g。

4.2 檢測方法的確定 通過DAD掃描，麥角甾醇在283 nm處有最大吸收值，色譜條件以Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱，甲醇為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測波長為283 nm，進(jìn)樣量為10 μL。麥角甾醇在9.28～148.50 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，且穩(wěn)定性好、精密度高，適合對金蟬花麥角甾醇進(jìn)行檢測。

4.3 金蟬花的藥用前景 蟲草類真菌能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)，在生物技術(shù)及醫(yī)療保健上有重要的作用。經(jīng)臨床研究及藥效學(xué)分析，金蟬花的活性成分種類、含量及功效并不亞于冬蟲夏草，而相較于冬蟲夏草，金蟬花價(jià)格相對低廉，生態(tài)要求比較低，故金蟬花潛在的醫(yī)療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值非常巨大，市場前景非常廣闊。

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Optimization of extraction technology of ergosterol in cordyceps cicadae by response surface methodology

YANG An-lun1*,CHEN Zhong2,LI Jian-sheng3

(1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou 310006,China;2.Zhejiang Chinese Medical University Medical Pieces.,LTD,Hangzhou 311401,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

Objective To optimize the extraction process of ergosterol in cordyceps cicadae.Methods Based on single factor tests,central composite design-response surface methodology was applied to optimize the process with ethanol concentration,extraction temperature and extraction time as independent variables,and the extraction amounts of ergosterol as dependent variable.Design-Expert 8.0.6 statistic analysis software was used to fit multivariate linear equation and second-order polynomial equation for experimental data,and delineate response surface and contour plot.Results The best technical condition was as follows:the extraction lasted for 38 min under 74 ℃ with 88% alcohol as the extration solvent.The linear range of ergosterol was 9.28～148.50 μg/mL and the average recovery rate was 97.99%.Conclusion The method is simple and rapid,and it provides scientific basis for the safety and effectiveness of cordyceps cicadae in clinical use.

Cordyceps cicadae;Ergosterol;Extraction technology;HPLC;Central composite design-response surface methodology

2015-03-04

1.浙江省中醫(yī)院，杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，杭州 311401；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃(2013ZA027)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511021

*通信作者