劉　莉, 袁　紅, 馬　玲, 單　莉

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肺內(nèi)科; 2. 中國人民解放軍第四七四醫(yī)院 呼吸科, 新疆 烏魯木齊, 830011)

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多西他賽聯(lián)合順鉑對肺癌A549細(xì)胞熱休克蛋白70表達(dá)的影響

劉莉1, 袁紅2, 馬玲1, 單莉1

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肺內(nèi)科; 2. 中國人民解放軍第四七四醫(yī)院 呼吸科, 新疆 烏魯木齊, 830011)

摘要:目的探討多西他賽聯(lián)合順鉑對人肺癌細(xì)胞株(A549細(xì)胞)熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞，分別采用多西他賽20μg/mL、順鉑5μg/mL及二者聯(lián)合用藥處理細(xì)胞，另設(shè)不加藥物處理的對照組，MTT法檢測A549細(xì)胞增殖活力；同時采用Western Blot檢測順鉑、多西他賽及二者聯(lián)合用藥分別處理細(xì)胞后，HSP70表達(dá)量的變化。結(jié)果MTT法顯示，多西他賽、順鉑、多西他賽聯(lián)合順鉑處理A459細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞活性明顯低于對照組(P<0.01); 聯(lián)合組細(xì)胞活性顯著低于多西他賽組和順鉑組(P<0.01); Western Blot顯示，多西他賽組、順鉑組、聯(lián)合組HSP70表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01); 聯(lián)合用藥組HSP70表達(dá)低于單獨(dú)用藥組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論多西他賽與順鉑均具有抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖作用，二者聯(lián)用具有協(xié)同作用，其機(jī)制可能與下調(diào)HSP70的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:多西他賽; 順鉑; 熱休克蛋白70; A549細(xì)胞

熱休克蛋白(HSP)是機(jī)體在不良環(huán)境因素應(yīng)激作用下產(chǎn)生的具有高度保守性的一種應(yīng)激蛋白，它通過影響細(xì)胞增殖過程的蛋白構(gòu)象進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，并與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[1]。HSP70是HSP中重要的一種蛋白，在細(xì)胞應(yīng)激后生成較為顯著，且對細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[2]。研究表明，HSP70與癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，在一些腫瘤，如肺癌、胰腺癌組織中有不同程度的表達(dá)[3-4]。肺癌為目前世界各國發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，對人類健康造成極大的威脅?；熓欠伟┲委煹闹饕緩?，尤其是聯(lián)合化療?？色@得較理想的效果。多西他賽是第三代細(xì)胞毒性化療藥，在非小細(xì)胞肺癌的治療中表現(xiàn)出了良好療效，是目前唯一得到歐洲和美國FDA批準(zhǔn)并用于非小細(xì)胞肺癌一線化療藥物，與鉑類聯(lián)合治療肺癌的效果可靠[5]。本研究通過觀察臨床常用化療藥多西他賽聯(lián)合順鉑對體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)增殖的影響，探討其對腫瘤細(xì)胞的抑制機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1　試劑與藥品

多西他賽、順鉑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；小鼠抗人HSP70單克隆抗體購自美國SantaCruz生物技術(shù)公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小牛血清購自杭州四季青公司；人肺癌細(xì)胞株(A549細(xì)胞)由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供，用含10%小牛血清及1%雙抗的1 640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[6]。

1.2　實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入對數(shù)期后，對照組：只更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，不加藥物處理；多西他賽組：棄去培養(yǎng)液，加入含多西他賽20 μg/mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；順鉑組：棄去培養(yǎng)液，加入含順鉑5 μg/mL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；聯(lián)合組：棄去培養(yǎng)液，加入含兩藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3　MTT法檢測A549細(xì)胞生長變化

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞, 0.25%胰蛋白酶消化制備為單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×107/L, 接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，200 μL/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞鐵壁后棄原培養(yǎng)液，給予上述不同處理，各組設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)空白對照孔(只含培養(yǎng)液不含細(xì)胞)，置37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 取出板子。每孔加5 g/L四甲基偶氮唑鹽(MTT)20 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液加150 μL/孔DMSO, 室溫震蕩15 min, 酶標(biāo)儀492 nm檢測各孔吸光度(A值)，計算生長增殖率。細(xì)胞生長增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組)/(對照組A值-空白組A值)×100%。重復(fù)3次。

1.4　Western Blot法檢測HSP70蛋白的表達(dá)

取對照組和不同藥物處理后的A459細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液和PMSF，在冰上反復(fù)吹打30 min使細(xì)胞充分裂解, 4 ℃, 12 000 g離心10 min, 吸取上清即細(xì)胞蛋白提取液?？偟鞍仔忻笜?biāo)儀蛋白濃度測定，調(diào)整蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，含蛋白的硝酸纖維膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后分別孵育鼠抗人HSP70抗體為一抗、羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行免疫印跡分析。孵育完抗體的硝酸纖維膜用ECL顯色，應(yīng)用GELPro Analyzer(4.0 version)圖形分析軟件進(jìn)行定量分析。

2結(jié)果

2.1　各組A459細(xì)胞增殖率比較

多西他賽、順鉑、多西他賽聯(lián)合順鉑處理A459細(xì)胞后，細(xì)胞活性均低于對照組，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 多西他賽組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，聯(lián)合組顯著低于多西他賽組和順鉑組(P<0.01)。見表1。

表1　A459細(xì)胞增殖率比較

與對照組比較，**P<0.01; 與聯(lián)合組比較，##P<0.01。

2.2　各組A459細(xì)胞HSP70蛋白的表達(dá)水平

多西他賽組、順鉑組、聯(lián)合組與對照組相比，HSP70表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01); 多西他賽與順鉑組比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05); 聯(lián)合組HSP70表達(dá)低于單獨(dú)用藥組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3討論

生物細(xì)胞在受到各種理化因素和其他應(yīng)激因素，如缺血、缺氧、毒物、細(xì)菌或病毒感染、DNA損傷等作用后可發(fā)生熱休克反應(yīng)，進(jìn)而抑制一些正常蛋白質(zhì)的合成，同時啟動一類高度保守的基因合成HSP，此現(xiàn)象被稱為熱休克應(yīng)答[6]。HSP廣泛存在于原核和真核生物，具有“分子伴侶”的作用，HSP主要功能是在應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)細(xì)胞生命活動。近年有研究發(fā)現(xiàn)，HSP通過原癌基因和抑癌基因及其蛋白產(chǎn)物的相互作用以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖[7]。此外，HSP70在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷的控制、基因產(chǎn)物的代謝及癌變方面發(fā)揮重要的作用[8]，是腫瘤和感染性疾病免疫的重要分子，在細(xì)胞應(yīng)激后生成較顯著，能與多種癌基因、抑癌基因相互作用，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化等過程[9]。

表2　各組A459細(xì)胞HSP70蛋白的表達(dá)水平比較±s)

與對照組比較，*P<0.05, **P<0.01;

與聯(lián)合組比較，#P<0.05。

多西他賽為紫杉類抗腫瘤藥物，其機(jī)制是加強(qiáng)微管蛋白聚合和抑制微管解聚，從而抑制腫瘤細(xì)胞有絲分裂和增殖，起到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用[10]。體外實(shí)驗(yàn)表明，多西他賽在腫瘤細(xì)胞內(nèi)濃度較高且在細(xì)胞內(nèi)潴留時間長，對過度表達(dá)P-糖蛋白的多種腫瘤細(xì)胞株具有活性，抗腫瘤譜廣[11]。順鉑是金屬鉑類絡(luò)合，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于雙功能烷化劑，可與DNA雙鍵上的核酸形成鏈內(nèi)和鏈間交叉聯(lián)結(jié)，破壞DNA功能，具有細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞DNA再復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。多西他賽聯(lián)合順鉑是國際公認(rèn)的非小細(xì)胞肺癌化療一線治療方案。Jahanzeb等[13]報道多西他賽聯(lián)合順鉑每三周方案治療ⅢB期和Ⅳ期肺癌，減少多西他賽用量可降低粒細(xì)胞下降的副作用，且不降低其有效率，中位生存期達(dá)到12個月。本研究中多西他賽、順鉑、多西他賽聯(lián)合順鉑處理A459細(xì)胞后，細(xì)胞活性均低于對照組，多西他賽聯(lián)合順鉑作用于A459細(xì)胞后細(xì)胞活性顯著低于其他單藥組，表明聯(lián)合應(yīng)用能協(xié)同加強(qiáng)細(xì)胞對藥物的敏感性，抑制細(xì)胞增殖作用加強(qiáng)，且聯(lián)合應(yīng)用后HSP70表達(dá)最低，表明二者的協(xié)同作用能對抗HSP70對腫瘤的保護(hù)作用，提示聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞的生長抑制作用可能是通過降低HSP70表達(dá)而發(fā)生的。

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Influence of docetaxel combined with platinum on expression of HSP70 in lung cancer A549 cells

LIU Li1, YUAN Hong2, MA Ling1, SHAN Li1

(1.DepartmentofPulmonaryMedicine,AffiliatedCancerHospitalofXinjiangMedicalUniversity; 2.Departmentofrespiratory,TheNO.474ChinesePeople′sLiberationArmyHospital,Urumchi,Xinjiang, 830011)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of docetaxel combined with platinum on the expression of heat shock protein 70 (HSP70) in human lung cancer cell line (A549 cells). MethodsLung cancer A549 cells were in-vitro cultured and treated with docetaxel 20 μg/mL (docetaxel group), platinum 5 μg/mL (platinum group) and docetaxel combined with platinum (combination group), respectively, and control group without drug treatment was established. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) was used to detect the activity of A549 cell proliferation and Western Blot to detect the changes of HSP70 expression after treated with docetaxel, platinum and docetaxel combined with platinum, respectively. ResultsMTT method showed that after treatment, cell proliferation was evidently inhibited in all groups and cell activity was markedly lower than control group (P<0.01), and combination group was prominently lower than docetaxel group and platinum group in cell activity (P<0.01). Western Blot results indicated that HSP70 expression decreased obviously in all groups (P<0.05,P<0.01), and was notably lower in combination group than in other two groups (P<0.05). ConclusionBoth docetaxel and platinum can inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells, and their combined application has synergetic action, whose mechanism is in association with the down-regulation of HSP70 expression.

KEYWORDS:docetaxel; platinum; heat shock protein 70; A549 cells

通信作者:單莉, E-mail: 19834895@qq.com

基金項目:新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金XJC201031

收稿日期:2015-01-04

中圖分類號:R 734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)17-048-03

DOI:10.7619/jcmp.201517015