桂林生，昝林森，2＊，王洪寶，2，王洪程

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100；2.國(guó)家肉牛改良中心，楊凌712100）

信息沉默調(diào)節(jié)因子1（Silent mating type information regulator 1，SIRT1）屬于Sirtuin家族，是一類依賴煙堿胺腺嘌呤（NAD＋）的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，定位于細(xì)胞核中且具有高度保守性［1-2］。在人和動(dòng)物機(jī)體的糖代謝、脂代謝和胰島素分泌等生理過程中，SIRT1發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。作為調(diào)節(jié)脂肪形成最主要的轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ基因被證實(shí)可以調(diào)控脂肪酸的儲(chǔ)存和葡萄糖的代謝［3］，研究表明，SIRT1基因可以通過與SMRT基因相結(jié)合，抑制PPARγ的活性，進(jìn)而降低脂肪細(xì)胞分化速度，減少脂肪沉積［4］。此外，作為SIRT1基因的有效激活劑，白藜蘆醇飼喂的小白鼠在抵抗高脂飲食引起的肥胖效果顯著高于對(duì)照組，這說明SIRT1基因可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程［5-7］。信息沉默調(diào)節(jié)因子2（Silent mating type information regulator 2，SIRT2）同樣屬于Sirtuin家族，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，與微管共定位，完成對(duì)α-微管蛋白的去乙酰化作用，在結(jié)構(gòu)上與SIRT1具有高度同源性［8-9］。在小鼠3T3-L1細(xì)胞上的研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)SIRT2基因可以有效抑制前體脂肪細(xì)胞的分化［10］，這可能是因?yàn)镾IRT2基因可以結(jié)合并去乙酰化Foxo1基因，促進(jìn)Foxo1基因?qū)PARγ基因的抑制作用［11］。類似的結(jié)果在豬的前體脂肪細(xì)胞中同樣被證實(shí)［12］。

肉用性狀是畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，是衡量育種價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)。鑒于這兩個(gè)基因在脂質(zhì)代謝過程中的重要作用，推測(cè)其在畜禽的肉用方面可能發(fā)揮直接或間接的作用，目前尚未見到相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以SIRT1和SIRT 2基因?yàn)槟繕?biāo)基因，采用PCR-PFLP方法分析不同標(biāo)記基因型及合并基因型對(duì)秦川牛肉用性狀的影響，以期為秦川牛分子育種提供新的理論方法和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

血樣采自陜西省良種肉牛繁育中心、陜西省秦川牛保種場(chǎng)和西北農(nóng)林科技大學(xué)良種肉牛繁育中心3個(gè)場(chǎng)區(qū)，隨機(jī)選擇505頭同等飼養(yǎng)條件下無親緣關(guān)系的18～24月齡健康的秦川牛，對(duì)每頭牛頸靜脈采血10 m L，ACD抗凝（V（ACD）∶V（血液）＝1∶6），置于-80℃ 保存?zhèn)溆?。肉用性狀包括背膘厚、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪含量3個(gè)指標(biāo)。本試驗(yàn)肉用性狀使用超聲波背膘儀測(cè)定，測(cè)定之前在牛背部第12肋骨附近上下均勻涂上清油，等待1～2 min后開始檢測(cè)。

1.2 秦川牛基因組DNA的提取及檢測(cè)

采用常規(guī)的酚-氯仿提取法［13］提取秦川牛血樣基因組DNA，提取后的DNA用TE緩沖液溶解后，采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，然后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 秦川牛SIRT1和SIRT2基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank公布的牛SIRT1（NM＿001192980.1）和SIRT2的序列（NM＿001113531.1），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系30.0μL，含有核酸染料的d NTPs、Taq DNA聚合酶、10×Buffer的Mix 15.0 μL，dd H2O 11.8μL，上、下游引物各（10 pmol·μL-1） 0.6μL、模板DNA（50 ng·μL-1）2.0μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序

在擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物中，每種隨機(jī)選取8個(gè)樣本使用凝膠回收試劑盒回收純化，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行對(duì)比分析，尋找突變位點(diǎn)。

表1 秦川牛SIRT1和SIRT2基因引物序列信息Table 1 Sequence information of primers amplifying Qinchuan cattle in SIRT1 and SIRT2 genes

1.5 PCR-PFLP分析

經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，取含有突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，依照所測(cè)突變位點(diǎn)G25764A、A25846G、C19501T和C19518T的順序，分別加入限制性內(nèi)切酶Bfa 1（Fermentas，Canada）、Sat 1（Fermentas，Canada）、Tai 1（Fermentas，Canada）和Xba 1（Fermentas，Canada）1.0μL，酶切10×Buffer 2.0μL，加入去離子水至20μL，反應(yīng)體系置于37℃恒溫箱中過夜。然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)照相分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)基因型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果計(jì)算基因型、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hard-Weinberg平衡適應(yīng)性檢驗(yàn)。采用SPSS（13.0 version）軟件［14］分別對(duì)SIRT 1和SIRT 2基因突變位點(diǎn)的合并基因型與秦川牛部分肉用性狀（背膘厚、眼肌面積和肌間脂肪含量）進(jìn)行相關(guān)性分析。同時(shí)，分析SIRT1和SIRT 2基因之間的合并基因型與秦川牛肉用性狀的關(guān)聯(lián)性。單基因效應(yīng)和多基因效應(yīng)方差分析模型：?jiǎn)位蛐?yīng)方差分析：表型觀察值＝群體均值＋標(biāo)記基因型效應(yīng)＋年齡效應(yīng)＋隨機(jī)誤差；合并基因型方差分析：表型觀察值＝群體均值＋SIRT 1基因型＋SIRT 2基因型＋SIRT 1與SIRT 2互作效應(yīng)＋隨機(jī)誤差。

2 結(jié) 果

2.1 秦川牛SIRT1和SIRT2基因PCR擴(kuò)增

根據(jù)牛SIRT1（NM＿001192980.1）和SIRT2的序列（NM＿001113531.1），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，而后對(duì)SIRT 1和SIRT 2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。

2.2 SIRT1和SIRT2不同位點(diǎn)基因型分析

牛SIRT1基因位于第28號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)26 517 bp，含9個(gè)外顯子。通過測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因3′側(cè)翼區(qū)存在2處SNPs，分別是G25764A（圖2A）和A25846G（圖2B）。G25764A位點(diǎn)存在GG和GA兩種基因型，命名為AA和AB；A25846G位點(diǎn)存在AA、AG和GG 3種基因型，分別命名為AA、AB和BB。牛SIRT2基因位于第18號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)19 838 bp，含16個(gè)外顯子。本試驗(yàn)同樣在SIRT 2基因3′側(cè)翼區(qū)檢測(cè)到2個(gè)SNPs，分別是C19501T（圖3A）和C19518T（圖3B），C19501T位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)CC和CT兩種基因型，命名為AA和AB；C19518T位點(diǎn)存在CC、CT和TT 3種基因型，分別命名為AA、AB和BB。具體酶切效果見圖4和圖5。

圖1 SIRT1和SIRT2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Detection of PCR products of SIRT1 and SIRT2

圖2 SIRT1基因G25764A（A）和A25846G（B）基因型測(cè)序圖Fig.2 Sequencing diagram at site G25764A（A）and A25846G（B）of SIRT1 gene

表2 秦川牛SIRT1和SIRT2不同位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率Table 2 Genotype and allele frequency of SIRT1 and SIRT2 at different sites

圖3 SIRT2基因C19501T（A）和C19518T（B）基因型測(cè)序Fig.3 Sequencing diagram at site C19501T（A）and C19518T（B）in SIRT2 gene

圖4 SIRT1基因G25764A（A）和A25846G（B）酶切Fig.4 The restriction map of G25764A（A）and A25846G（B）in SIRT1 gene

圖5 SIRT2基因C19501T（A）和C19518T（B）酶切Fig.5 The restriction map of C19501T（A）and C19518T（B）in SIRT2 gene

本研究從群體遺傳學(xué)角度分別分析了這4個(gè)突變位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量的遺傳指標(biāo)（表2），并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)檢測(cè)了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。結(jié)果顯示，SIRT1基因G25764A和A25846G處，AA和BB分別為優(yōu)勢(shì)基因型，A是G25764A的優(yōu)勢(shì)等位基因，而B則是A25846G的優(yōu)勢(shì)等位基因；SIRT2基因C19501T和C19518T處，AA和AB分別為優(yōu)勢(shì)基因型，A同為這兩個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因?？ǚ綑z驗(yàn)表明，4個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.3 SIRT1和SIRT2不同基因型對(duì)秦川牛肉用性狀的影響

對(duì)505頭健康秦川牛的3個(gè)肉用性狀分別與SIRT1基因各突變位點(diǎn)的基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示（表3），G25764A位點(diǎn)不同基因型在眼肌面積方面差異極顯著（P＜0.01），AA基因型個(gè)體均值顯著高于AB型。A25846G位點(diǎn)上，AA基因型眼肌面積的個(gè)體均值極顯著大于AB基因型均值（P＜0.01），同時(shí)顯著高于BB基因型（P＜0.05）。對(duì)SIRT 2基因而言，C19501T位點(diǎn)上的AA基因型肉用性狀表現(xiàn)最優(yōu)，眼肌面積和肌間脂肪均值分別比AB基因型均值高4.09 cm2和0.31%，差異顯著（P＜0.05）。C19518T位點(diǎn)上的BB基因型為優(yōu)良基因型，在背膘厚方面，BB基因型顯著高于AA基因型（P＜0.05）；AB基因型個(gè)體的肌間脂肪含量顯著大于AA基因型（P＜0.05），但與BB基因型差異不顯著（P＞0.05）。

表3 SIRT1和SIRT2不同基因型對(duì)秦川牛肉用性狀的影響Table 3 Effect of different genotypes at SIRT1 and SIRT2 sites on meat quality traits in Qinchuan cattle

2.4 SIRT1和SIRT2基因合并基因型對(duì)秦川牛肉用性狀的影響

經(jīng)分析得出，兩個(gè)基因中4個(gè)位點(diǎn)共有22種合并基因型，將發(fā)生頻率低于5.00%的13種合并基因型定義為其他類型。表4顯示，AA-BB-AA-AB發(fā)生頻率最高，達(dá)到25.34%，其次為AA-BB-AAAA和AA-BB-AA-BB，頻率分別為21.98%和16.63%。利用合并基因型方差分析模型分析不同合并基因型對(duì)秦川牛肉用性狀的影響，結(jié)果顯示，合并基因型對(duì)背膘厚、眼肌面積以及肌間脂肪影響顯著。由表5可見，合并基因型AB-BB-AA-BB個(gè)體的背膘厚極顯著高于AA-BB-AA-AA、AA-BB-AABB和AB-AB-AA-AB3個(gè)合并基因型（P＜0.01），并且顯著高于AA-BB-AA-AB合并基因型個(gè)體（P＜0.05）。盡管AA-BB-AA-AB合并基因型個(gè)體的眼肌面積大于AB-BB-AA-BB合并基因型個(gè)體，但差異不顯著（P＞0.05），這兩組合并基因型均極顯著高于AB-AB-AA-AB合并基因型（P＜0.01）。肌間脂肪含量方面，合并基因型AB-BB-AA-BB個(gè)體均值極顯著高于AA-BB-AA-AA和AB-AB-AA-AB兩組合并基因型（P＜0.01），并與合并基因型AA-BB-AA-BB之間存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，在本試驗(yàn)群體中，AB-BB-AA-BB可被視為一種最為優(yōu)秀的合并基因型。

表4 秦川牛SIRT1和SIRT2合并基因型分布情況Table 4 The distribution of combined genotypes at SIRT1 and SIRT2 loci in Qinchuan cattle

表5 SIRT1-SIRT2合并基因型對(duì)秦川牛肉用性狀的影響Table 5 Effect of different combined genotypes of SIRT1-SIRT2 on meat quality traits in Qinchuan cattle

3 討 論

目前，動(dòng)物基因聚合育種技術(shù)逐步在畜禽生產(chǎn)中得到應(yīng)用。李國(guó)輝等在白耳雞群體中對(duì)GH、POU1F1和PRL基因的單基因及聚合基因型對(duì)產(chǎn)蛋率影響的研究，結(jié)果表明2個(gè)或3個(gè)優(yōu)勢(shì)基因聚合的遺傳效應(yīng)高于優(yōu)勢(shì)單基因型的遺傳效應(yīng)［15］，類似的結(jié)果在張學(xué)余的研究中得到了證實(shí)［16］。郭云雁等在豬上發(fā)現(xiàn)，MyoG和c-fos基因的有利合并基因型和不利合并基因型個(gè)體的各性狀（背膘厚除外）間差異均達(dá)到了顯著或極顯著水平［17］。在反芻動(dòng)物方面，合并MC4R和PROP 1基因型對(duì)中國(guó)美利奴羊生長(zhǎng)性狀有一定的影響［18］。以上研究我們可以發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)多基因聚合育種是切實(shí)可行的，將更有利于利用標(biāo)記輔助選擇對(duì)畜禽進(jìn)行遺傳改良。

秦川牛是我國(guó)著名的五大地方黃牛之一，具有肉役性能突出、遺傳穩(wěn)定和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性，然而其生長(zhǎng)發(fā)育較慢，后軀肌肉欠充實(shí)的缺陷也比較明顯［19］。目前，針對(duì)秦川牛的遺傳改良多集中于單一基因的多態(tài)性研究［20-22］，鑒于基因聚合育種技術(shù)在畜禽上的逐步應(yīng)用，本試驗(yàn)挑選兩個(gè)與機(jī)體脂肪代謝相關(guān)聯(lián)的基因，研究單基因多態(tài)性及合并基因型與秦川牛肉用性狀的關(guān)聯(lián)分析。

SIRT 1基因在機(jī)體內(nèi)可以通過對(duì)幾種調(diào)控代謝及內(nèi)分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)錄因子去乙酰化作用來調(diào)節(jié)其活性，在調(diào)控糖脂代謝、胰島素分泌和基因轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮重要的作用［23］。目前，在人和小鼠上研究的比較全面。M.X.Li等研究表明，SIRT1基因-274C＞G突變與24月齡南陽(yáng)牛的體尺性狀顯著相關(guān)［24-25］。本試驗(yàn)通過PCR-PFLP對(duì)秦川牛SIRT 1基因全長(zhǎng)進(jìn)行了多態(tài)性分析，結(jié)果檢測(cè)到了在3′側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別是G25764A和A25846G。通過不同基因型與秦川牛肉用性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，G25764A位點(diǎn)不同基因型在眼肌面積方面差異極顯著（P＜0.01），AA基因型個(gè)體均值顯著高于AB型。A25846G位點(diǎn)上不同基因型同樣在眼肌面積方面存在顯著性差異，AA基因型個(gè)體均值極顯著高于AB基因型個(gè)體均值（P＜0.01），并顯著高于BB基因型個(gè)體均值（P＜0.05）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)與M.X.Li等的結(jié)果不相一致，這可能是由于樣本選擇上的差異所導(dǎo)致的。

盡管SIRT 2基因與SIRT 1基因的細(xì)胞定位不同，但作用機(jī)制大致相似，均可以通過結(jié)合并去乙?；喾N轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控糖脂代謝［26］。目前，尚未見其他有關(guān)SIRT2基因在動(dòng)物上的多態(tài)性研究。本試驗(yàn)在SIRT 2基因的3′側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變位點(diǎn)均對(duì)秦川牛肉用性狀有一定的影響。其中C19501T位點(diǎn)上的AA基因型和C19518T位點(diǎn)上的BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。眼肌面積和肌間脂肪方面，C19501T的AA基因型個(gè)體均值均顯著高于AB基因型（P＜0.05）；C19518T的BB基因型個(gè)體背膘厚均值顯著高于AA基因型（P＜0.05）；AB基因型個(gè)體的肌間脂肪顯著大于AA基因型（P＜0.05），但與BB基因型差異不顯著（P＞0.05）。

通過合并SIRT 1和SIRT 2基因發(fā)現(xiàn)，合并基因型各組之間的背膘厚，眼肌面積和肌間脂肪之間差異顯著（P＜0.05或P＜0.01）。其中合并基因型AB-BB-AA-BB個(gè)體的背膘厚和肌間脂肪含量均值最高，盡管在眼肌面積方面略小于AA-BB-AA-AB合并基因型個(gè)體的均值，但差異不顯著（P＞0.05）。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因的聯(lián)合效應(yīng)要大于單基因?qū)η卮ㄅＨ庥眯誀畹男?yīng)，合并基因型AB-BB-AABB為最優(yōu)秀的合并基因型。如果單純的疊加各位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因，合并基因型AA-BB-AA-BB所表現(xiàn)出來的肉用性狀應(yīng)優(yōu)于合并基因型AB-BB-AABB，這與本試驗(yàn)結(jié)果并不相符，說明了多基因聚合效應(yīng)絕不僅僅是各基因效應(yīng)的簡(jiǎn)單相加，聯(lián)合效應(yīng)可能優(yōu)于單個(gè)基因型效應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1（G25764A和A25846G）和SIRT2基因（C19501T和C19518T）在秦川牛中存在多態(tài)性，與部分肉用性狀顯著關(guān)聯(lián)。SIRT1和SIRT2基因的優(yōu)勢(shì)合并基因型為AB-BB-AA-BB，其個(gè)體的背膘厚、眼肌面積和肌間脂肪含量極顯著或顯著高于其他合并基因型，可以嘗試將SIRT 1和SIRT2基因作為影響生長(zhǎng)性狀的候選基因用于標(biāo)記輔助選擇，為秦川牛選育工作提供科學(xué)依據(jù)。

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