黃曉鋒，潘陽陽，許 芳，曾巧英

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

甘肅省豬香港病毒的巢式PCR檢測及VP1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

黃曉鋒，潘陽陽，許 芳，曾巧英*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

豬香港病毒(PHoV)于2008年在我國香港首次發(fā)現(xiàn)，屬細小病毒新成員。本研究自甘肅省蘭州、張掖、天水市養(yǎng)豬場和屠宰場采集血液樣品147份，針對PHoV的VP1基因保守區(qū)(GenBank No.EU200677)設(shè)計2對引物，用巢式PCR(nPCR)檢測PHoV。結(jié)果，甘肅省生豬PHoV總陽性率為38.10%(56/147)。其中，12周齡以上豬的陽性率(55.56%)顯著高于6周齡以下豬(25.00%)(P<0.05)；三地區(qū)間的陽性率差異不顯著(P>0.05)。從56份陽性樣本中挑選具地域代表性的12份，對VP1擴增片段測序(GenBank注冊號：JQ177084～JQ177095)，并和GenBank中的所有VP1序列一起進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，12個VP1片段序列之間的相似性為95.2%～99.0%。其中，JQ177093、JQ177085和JQ177089構(gòu)成一個獨立的分支；其余9株和來自GenBank的12株參考序列均處于另一分支。9株中，JQ177095、JQ177087和JQ177091構(gòu)成一個亞分支，緊鄰羅馬尼亞野豬株(JF738366)；JQ177086、JQ177090和JQ177094構(gòu)成第二個亞分支，緊鄰香港株HK3；JQ177088、JQ177092和JQ177084構(gòu)成第三個亞分支，緊鄰香港株HK5。12株P(guān)HoV的VP1基因片段序列與香港株HK1～HK6的總體相似性為96.7%～99.7%，與羅馬尼亞野豬株為95.2%～99.0%。本研究結(jié)果表明，源于羅馬尼亞野豬株和香港株的PHoV均在甘肅省豬群中高水平流行。

豬香港病毒；巢式PCR；基因序列；系統(tǒng)發(fā)育分析

豬香港病毒(porcine Hokovirus，PHoV)于2008年在我國香港首次發(fā)現(xiàn)[1]，是近年來幾個新發(fā)現(xiàn)的細小病毒之一，其基因組全長與其他細小病毒接近，約為5 kb，含有2個ORF。其中，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2[2-3]。至目前，PHoV僅在德國、美國、喀麥隆、羅馬尼亞家豬和野豬群中被檢出[4-10]。該病毒感染后在淋巴結(jié)、血清、肝、脾、鼻拭子和糞便中均能夠檢測到PHoV[1，4-5，8-9]。我國東部地區(qū)和北京地區(qū)檢出該病毒的陽性率為11%～70%[8-10]，甘肅省地處中國西北，有無該病毒的流行尚未見報道。為此，本研究選擇甘肅省從東至西三個地理位置有代表性的城市，從養(yǎng)豬場表觀健康仔豬群和生豬屠宰點采集血液樣品，用巢式PCR(nested PCR，nPCR)擴增該病毒的VP1序列，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在澄清甘肅省有無PHoV的流行，并且基于VP1基因序列分析其流行的PHoV和世界范圍內(nèi)已報道PHoV之間的分子演化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

5×MyTaq Red Buffer、MyTaq DNA Polymerase均購自德國Bioline GmbH公司；病毒DNA提取試劑盒OMEGA DNA Mini Kit購自美國OMEGA公司；PCR產(chǎn)物膠回收純化試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購自德國QIAGEN公司；PMD18-T vector、T4 DNA ligase、competentE.coliDH5α cells 均購自TaKaRa公司。

1.2 樣品采集

2012.3-2012.8，從甘肅省三個地區(qū)(蘭州、張掖、天水)養(yǎng)豬場(0～6周齡仔豬)和生豬屠宰點(12周齡以上豬)采集健康豬血樣147份，其中蘭州54份(L1～L54)，張掖51份(Z1～Z51)，天水42份(T1～T42)，共計84份仔豬血樣，63份屠宰豬血樣，均置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 針對PHoV的VP1序列設(shè)計nPCR引物

據(jù)PHoV HK7(GenBank No.：EU200677) 基因序列，在NS1和VP1保守區(qū)設(shè)計2對nPCR引物，分別用于第一輪和第二輪PCR擴增[9-10](表1)。

1.4 樣品的nPCR檢測

DNA模板制備：血樣經(jīng)DNA提取試劑盒(OMEGA)提取純化，調(diào)整濃度后置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

兩輪PCR采用相同的反應(yīng)體系：5×MyTaq Red Buffer 10 μL；上下游引物各0.5 μL(25pmol·μL-1)；MyTaq DNA Polymerase 1 U；DNA模板1 μL；ddH2O補足至50 μL。其中第一輪的模板為血樣提取DNA，第二輪的模板為第一輪PCR擴增產(chǎn)物的 10倍稀釋液。設(shè)PHoV上海株[9]為陽性對照，純水為陰性對照。

表1 針對PHoVVP1序列的nPCR引物

Table 1 Primers targeting PHoVVP1 gene sequence for nPCR

階段Phase引物序列(5′?3′)Primersequences(5′?3′)退火溫度/℃TemperaturePCR產(chǎn)物/bpPCRproduct參考序列Referencesequence第一輪PCRFirstroundPCRF：TTGGAGGTACCGGCAGAR：TCATCGTACCGTTCATCG57995EU200677(NS1/VP1區(qū))(NS1/VP1region)第二輪PCRSecondroundPCRF：GCAGTCTGCGCTTAACTTR：CTGCTTCATCCACTGGTC58391EU200677(VP1區(qū))(VP1region)

反應(yīng)條件：第一輪為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增35個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。第二輪為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴增35個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。取第二輪PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察。統(tǒng)計檢測結(jié)果，并用t檢驗法進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 nPCR擴增所得VP1基因片段的純化回收與測序

分別從3地區(qū)兩個年齡組各選2個nPCR檢測陽性樣本，共12個樣本，經(jīng)QIAquick膠回收試劑盒純化擴增的VP1片段，連接至PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，送上海生工公司測序。

1.6 基于VP1基因片段序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對12個測序的VP1片段序列，經(jīng)BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)序列分析后，和GenBank中的參考序列一并用CLUSTAL W DNAMAN 6.0(version 1.4) 進行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA 4軟件采用鄰近歸并法評估不同系統(tǒng)發(fā)育組的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 臨床檢樣的PHoV檢測結(jié)果

經(jīng)nPCR擴增，第一輪PCR擴增目的片段為995 bp(圖1A)，第二輪擴增目的片段為391 bp(圖1B)，符合預(yù)期大小。圖示為部分檢樣，其余檢樣圖片略。147份豬血樣中，第一輪PCR擴增后，62份檢樣出現(xiàn)995 bp條帶，第二輪PCR后，僅有56份樣品出現(xiàn)391 bp條帶，總陽性數(shù)計為56?？傟栃月蕿?8.10%；12周齡以上豬的總陽性率(55.56%)顯著高于6周齡以下豬(25.00%)，各地區(qū)亦如此(P<0.05)；三地區(qū)的陽性率之間差異不顯著(蘭州40.74%；張掖37.25%；天水35.71%)(P>0.05)(表2)。

A.第一輪PCR擴增得995 bp片段；B.第二輪PCR擴增得391 bp片段；M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P.PHoV陽性對照；T1～L6.檢樣；N.陰性對照A. 995 bp fragment amplified by the first round PCR; B. 391 bp fragment amplified by the second round PCR；M.DL2000 DNA marker；P.HoV positive control; T1-L6. Samples; N. Negative control圖1 PHoV VP1序列的nPCR擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of VP1 sequences from PHoVs by nPCR

2.2 基于VP1基因片段序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

測序后，將12個VP1片段序列在GenBank中注冊(JQ177084～JQ177095)。與GenBank中已有的12個PHoVsVP1序列一起進行系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究獲得的12個VP1序列，相互間的相似性為95.2%～99.0%。其中，JQ177093、JQ177085和JQ177089構(gòu)成一個獨立的分支；其余9株和來自GenBank的12株參考序列均處于另一分支。9株中，JQ177095、JQ177087和JQ177091構(gòu)成一個亞分支，緊鄰羅馬尼亞野豬株(JF738367/EU-ROPHoV-WB)；JQ177086、JQ177090和JQ177094構(gòu)成另一個亞分支，緊鄰香港株EU200673/HK3；JQ177088、JQ177092和JQ177084構(gòu)成第三個亞分支，緊鄰香港株EU200675/HK5(圖2)。本研究檢測所得12個VP1核苷酸序列與香港株HK1～HK6的總體相似性為96.7%～99.7%，與羅馬尼亞野豬株相似性為95.2%～99.0%。

表2 甘肅省3個地區(qū)不同年齡豬PHoVs的nPCR檢測陽性率

Table 2 Prevalence of PHoVs in domestic pigs of different ages in 3 cities of Gansu province detected by nPCR assay

地區(qū)Location年齡/周Age(weeks)樣品數(shù)量NumberPHoV陽性數(shù)(陽性率/%)PHoVpositivenumber(positiverate)PHoV總陽性數(shù)(陽性率/%)PHoVpositivenumber(positiverate)蘭州Lanzhou≤6>1231238(25．81)14(60．87?)22/54(40．74)張掖Zhangye≤6>1226256(23．08)13(52．00?)19/51(37．25)天水Tianshui≤6>1227157(25．93)8(53．33?)15/42(35．71)總數(shù)Total≤6>12846321(25．00)35(55．56?)56/147(38．10)

*.P<0.05

圖2 PHoV VP1基因片段序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of VP1 gene sequences from PHoVs

3 討 論

PHoV是細小病毒科的新成員，2008年首次發(fā)現(xiàn)于我國香港的豬群，故名豬香港病毒，曾經(jīng)是細小病毒科香港病毒屬的唯一成員[1-3]，因為該病毒和人細小病毒4型及羊細小病毒4型遺傳關(guān)系親密，據(jù)此國際病毒分類委員會(ICTV)將此三種病毒歸為一個新的屬，即4型細小病毒屬(Tetraparvovirus)[2-3]。本病毒僅在中國[香港(44.4%)及大陸]、美國(22.2%)、德國(32.7%)、喀麥隆(47%)和羅馬尼亞(50.54%)有報道[2-7，9]。

本研究在甘肅省自0～6周齡和12周齡以上健康豬群采集血樣，經(jīng)nPCR檢測，PHoV總陽性率為38.10%(56/147)。關(guān)于陽性率計算，據(jù)nPCR的設(shè)計原理，其第二輪PCR是以第一輪產(chǎn)物為模板，目的是提高特異性和靈敏性：若第一輪PCR出現(xiàn)非特異條帶，經(jīng)第二輪引物的差異可剔除，提高特異性；若第一輪PCR產(chǎn)物濃度低于電泳的檢出閾值，經(jīng)第二輪可放大信號，提高靈敏性。故理論上只需以第二輪擴增結(jié)果計為最終陽性數(shù)。據(jù)此，本研究計第二輪擴增的56份陽性為最終陽性數(shù)。圖1顯示，本研究第一輪擴增后未出現(xiàn)大小異常的條帶，在第二輪擴增后，多數(shù)檢樣(T1、T3、Z4、L1、L5、L6)信號顯著增強，說明設(shè)計nPCR方法還是必要的；但有些檢樣(如L2)的兩輪信號相當(dāng)，更不尋常的是L3和Z3，第二輪擴增后條帶消失，和預(yù)期恰好相反；二輪信號的持平和消失，提示在二輪引物區(qū)出現(xiàn)了顯著的突變或缺失，導(dǎo)致引物的退火效率下降(L2)甚至根本不能結(jié)合(L3和Z3)。國外檢出的PHoV相似性高達98%～99%[1，4-5]，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的OFR1區(qū)(155—2 065 nt)為基因高變區(qū)，而編碼VP1和VP2的ORF2 (2 214—4 991 nt)保守[5]，本研究的第二輪引物正是基于此研究結(jié)論，靶標(biāo)VP1序列(2 588—2 978 nt)而設(shè)計，但據(jù)L3和Z3的結(jié)果可推斷VP1基因區(qū)也并非保守，而是同樣可高變。另，國內(nèi)2 125—2 129 nt位缺失株[10]的發(fā)現(xiàn)證明，ORF1-ORF2間隔區(qū)也可高變。上述證據(jù)均提示，相比國外分離株，國內(nèi)流行的PHoV，基因演化更活躍。理論上分析，本研究L3和Z3僅有的第一輪995 bp條帶，應(yīng)該是PHoV特異的陽性條帶，因為非特異條帶的大小如此吻合的概率甚小。為證實此推論及確認(rèn)第二輪沒有產(chǎn)物的確切原因，有待全基因測序與分析。若據(jù)此推論，以兩輪PCR的陽性總數(shù)計為最終總陽性數(shù)，則總陽性率為42.2%(62/147)，仍略低于我國東部地區(qū)(46.5%)[9]和北京(51.3%)[8]。

PHoV的陽性率在健康豬群和發(fā)病豬群之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異[1，4-5，8]，故本研究自健康豬群采集血樣檢測的PHoV陽性率具有客觀代表性。但關(guān)于具體的陽性率數(shù)據(jù)，不同的樣品(肝、脾、肺、血液、糞便)之間可能也會存在差異。和本病毒屬于同一個屬的羊4型細小病毒的檢測中，肝(66.7%)的檢出率表觀上略低于脾(71.4%)[11]。然而表觀數(shù)據(jù)的小差異并不影響研究的意義和結(jié)論。本研究的最大意義在于，證實了甘肅省存在豬香港病毒，且在豬群中高水平流行，陽性率可達38.10%。

至目前，PHoV只存在一個基因型，并沒有和地域相關(guān)的基因型出現(xiàn)。但據(jù)本研究VP1基因片段的序列演化分析，12個VP1序列相互間的相似性為95.2%～99.0%，且在進化樹中已經(jīng)呈現(xiàn)2個獨立的分支，相比世界范圍內(nèi)PHoV的相似性為98%～99%[1，4，5]，遺傳距離顯著增加，提示甘肅省流行的PHoV正在朝不同的方向演化。其中，JQ177093、JQ177085和JQ177089構(gòu)成一個獨立的分支，和另一分支相似性僅95.2%，提示VP1序列已經(jīng)出現(xiàn)新的演化方向；其余9株和來自GenBank的12個參考序列均處于另一分支，與羅馬尼亞野豬株序列(JF738366)和香港家豬HK1～HK3序列親緣關(guān)密切程度不等，是演化較慢的病毒群，但也證明甘肅省同時存在源于羅馬尼亞野豬株和香港家豬株的PHoV。

本研究基于VP1片段序列的分析結(jié)論和我國東部地區(qū)PHoVs 的全基因序列分析結(jié)論(95.4%～99.3%)[9]高度吻合，一致提示，我國流行的PHoVs 普遍比國外的演化速度要快。

因為PHoV是一個新病毒，很多生物學(xué)特性及致病性等均不明確。已有的證據(jù)表明，通常和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)混合感染，陽性率可高達47%[1，8]，但究竟在致病性中發(fā)揮多大作用，發(fā)揮何種作用均有待研究。肝、脾、淋巴結(jié)、血液、鼻腔、腸道等多組織臟器中均能夠檢測到該病毒[1-9]，提示該病毒沒有明確的組織嗜性，系全身性感染。檢出率隨豬的周齡而升高，包括血樣[4-5，9]，提示：一，如果該病毒對幼齡豬最易感或?qū)Ω髦荦g豬的易感性相當(dāng)，則該病毒自幼齡感染后能夠持續(xù)存在于全身組織及血液，即同時具有持續(xù)性感染和持續(xù)性病毒血癥的特性；二，反之，如果該病毒不具持續(xù)性感染和持續(xù)性病毒血癥的特性，那么，該病毒對豬的易感性隨周齡的增加而增加。

4 結(jié) 論

首次在甘肅省檢測到豬香港病毒(PHoV)的高水平流行(56/147，38.10%)，12周齡以上成年豬的陽性率(55.56%)顯著高于6周齡以下仔豬(25.00%)(P<0.05)?；赩P1基因片段序列的系統(tǒng)進化分析表明，源于羅馬尼亞野豬株(JF738366)和香港家豬株(HK1～HK6)的PHoV均在甘肅省流行。

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(編輯 白永平)

Detection of Porcine Hokovirus (PHoV) by Nested-PCR in Domestic Pigs in Gansu Province and Phylogenetic Analysis Based onVP1 Gene Sequences

HUANG Xiao-feng，PAN Yang-yang，XU Fang，ZENG Qiao-ying*

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

Porcine Hokovirus(PHoV) is a new parvovirus of pigs which was recently discovered in Hong Kong，China in 2008.In present study，a total of 147 blood samples were collected from pig farms and slaughter houses in Lanzhou，Zhangye and Tianshui city，Gansu province.Two pairs of primers were designed based onVP1 regions of PHoV genome(GenBank accession No.EU200677).One hundred and forty seven samples were detected by nested PCR(nPCR) assay for PHoV.The nPCR showed an overall prevalence of PHoV as high as 38.10%(56/147).Of which，>12-week-old pigs showed a significantly higher positive rate(55.56% ) than <6-week-old piglets(25.00%) (P<0.05)，while there was no significant differences among three cities (P>0.05).Out of the 56 positives，12 were selected in terms of geographical distribution for sequencing(GenBank accession No.：JQ177084-JQ177095).Phylogenetic analysis together with 11 referenceVP1 sequences of PHoV from GenBank revealed a homology of 95.2%-99.0% among the present 12VP1 sequences.Of which，JQ177093，JQ177085 and JQ177089 formed a separate branch in the phylogenetic tree，and other 9 together with 12 reference sequences from GenBank formed the second branch.Of the later 9，JQ177095，JQ177087 and JQ177091 formed a sub-branch closely related to JF738366 from wild boar in Romania，whereas JQ177086，JQ177090 and JQ177094 formed another sub-branch just next to HK3 from Hong-kong pigs，and the third sub-branch of JQ177088，JQ177092 and JQ177084 closely related to HK5.The present 12 PHoV-VP1 sequences shared a homogeneity of 95.2%-99.0% with Romania wild boar isolate (JF738366)，and 96.7%-99.7% with Hong Kong-originated HK1-HK6.The present findings confirmed a high prevalence of PHoVs both evolved from Romania wild boar isolate and Hong Kong pig isolates in Gansu province.

porcine Hokovirus(PHoV)；nested PCR(nPCR)；gene sequence；phylogenetic analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.014

2015-02-10

國家自然科學(xué)基金項目(30960284)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)伏羲杰出人才項目

黃曉峰(1985-)，男，甘肅臨洮人，碩士生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：panyangyang_2007@126.com

*通信作者：曾巧英(1968-)，女，博士，教授，主要從事動物疫病的分子致病機制及免疫防制研究，E-mail：zengqy@gsau.edu.cn，Tel：0931-7631783

S852.659.2

A

0366-6964(2015)10-1816-06