作者單位:541000 廣西 桂林,桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院

李曉佳

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MTX聯(lián)合復(fù)方風(fēng)濕寧對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞IL-22的影響

作者單位:541000 廣西 桂林,桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院

李曉佳

[摘要]目的觀察甲氨蝶呤(MTX)和風(fēng)濕寧對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞IL-22水平的影響,為其治療機(jī)制的研究提供新靶點(diǎn)。方法分離、純化、培養(yǎng)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織成纖維樣滑膜細(xì)胞,并分別加入MTX(MTX組)、復(fù)方風(fēng)濕寧(復(fù)方風(fēng)濕寧組)、MTX聯(lián)合復(fù)方風(fēng)濕寧(聯(lián)合組)進(jìn)行共培養(yǎng),MTT法檢測(cè)MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響；用RT-PCR方法檢測(cè)各組滑膜成纖維細(xì)胞IL-22及凋亡相關(guān)基因caspase-3和caspase-9 的mRNA表達(dá)。結(jié)果聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率和caspase-3、caspase-9 mRNA表達(dá)水平明顯高于其他兩組(P<0.05),IL-22 mRNA表達(dá)水平明顯低于其他兩組(P<0.05),但MTX組和復(fù)方風(fēng)濕寧組之間各項(xiàng)指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧均可降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞IL-22水平,抑制細(xì)胞增殖反應(yīng),且聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮協(xié)同效果,增強(qiáng)療效。

[關(guān)鍵詞]MTX；風(fēng)濕寧；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；滑膜；成纖維細(xì)胞；IL-22

Effect of MTX with compound Fengshining on synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with RA

Li XiaojiaGraduate School of Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, 541000, China

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of methotrexate (MTX) and compound Fengshining (FSN) on synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with rheumatoid arthritis (RA) in order to provide new targets for the research on the therapeutic mechanism.MethodsSynovial membrane fibroblasts of the patients with RA were obtained after separation, purification, and cultivation; and then, MTX (MTX group), compound FSN (compound FSN group), and MTX with compound FSN (combination group) were added respectively for further cultivation. MTT method was used to determine the effect of MTX and compound FSN on the proliferation of synovial membrane fibroblasts, RT-PCR method was used to determine the expression level of IL-22 and that of apoptosis-related caspase-3 and caspase-9 mRNA in every group.ResultsThe inhibitory rate of cell proliferation and expression levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in the combination group were significantly higher than those in the other two groups (P<0.05), and the expression level of IL-22 mRNA was significantly lower than that in the other two groups (P<0.05), but there was no significant difference in other indexes between the other two groups (P>0.05).ConclusionBoth MTX and compound FSN can reduce the level of synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with RA and inhibit the cell proliferation reaction, and combination application of them can obtain a synergistic effect and enhance the efficacy.

[Key words]MTX; Fengshining; rheumatoid arthritis; synovial membrane; fibroblast; IL-22

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)直接侵犯滑膜關(guān)節(jié),多數(shù)患者發(fā)病時(shí)成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)存在病理性增生[1]。IL-22主要由Th22細(xì)胞分泌,在炎癥免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中介導(dǎo)重要環(huán)節(jié)。國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)RAFLS細(xì)胞中存在IL-22的高表達(dá),且其表達(dá)程度與患者的疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[2-3]。甲氨蝶呤(MTX)是傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥之一,也是目前臨床治療RA的基本用藥。復(fù)方風(fēng)濕寧是針對(duì)RA發(fā)病特征而研制的純中藥制劑,由兩面針、七葉蓮、寬筋藤等六味中藥組成,具有祛風(fēng)止痛、活血化瘀、舒筋活絡(luò)等多重作用。本研究分析MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧對(duì)RAFLS細(xì)胞增殖及IL-22的影響,以為其聯(lián)合用藥提供理論支撐。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源人關(guān)節(jié)滑膜組織取自本院收治并行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者,采集后保存于無菌含雙抗Hanks液中,并于30 min之內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。RA診斷按照美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)1987 版標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要儀器和試劑低溫高速離心機(jī)(TGL20M,麥尚儀器)；酶標(biāo)分析儀(318C,上海精科)；梯度 PCR 擴(kuò)增儀(TP600,TAKARA)；凝膠成像分析儀(FR-980,上海復(fù)日)；電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-III2)；MTX片(上海信誼藥廠有限公司)；復(fù)方風(fēng)濕寧片(廣東羅浮山國(guó)藥股份有限公司)；caspase-3、caspase-9及IL-22引物由上海生工設(shè)計(jì)并提供,詳細(xì)序列如表1所示。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)采集滑膜組織后,仔細(xì)剔除連帶血管、脂肪及軟組織,以PBS液沖洗3~5次。將干凈的滑膜組織剪碎,以糊狀為宜,1000 r/min離心5 min,棄上清,先后用4 mg/ml的Ⅰ型膠原蛋白酶和0.25%的胰蛋白酶消化120 min(37 ℃、5% CO2恒溫孵育)。當(dāng)組織被消化為細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)時(shí),終止消化,懸浮于含青、鏈霉素(100 U/ml)及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2恒溫孵育。每隔72 h更換1次培養(yǎng)液,顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底、細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁的80%~90%時(shí),以胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。并留取第3~4代穩(wěn)定細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

表1　caspase-3、caspase-9及IL-22 的引物序列

1.3.2滑膜細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml,接種于96孔板,每孔100 μl,各取24孔作為對(duì)照組、MTX組、復(fù)方風(fēng)濕寧組和聯(lián)合組。MTX組加入0.1 g/L的MTX,復(fù)方風(fēng)濕寧組加入0.1 g/L的復(fù)方風(fēng)濕寧,聯(lián)合組同時(shí)加入兩種藥物各0.1 g/L,空白組為純培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,各組取6個(gè)樣品孔進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),每孔加入20 μl MTX(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄培養(yǎng)基,加入二甲基亞砜,每孔150 μl,振蕩搖勻,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(570 nm),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR):IR=[1-A(給藥)/A(對(duì)照)]×100%。

1.3.3RT-PCR測(cè)定caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表達(dá)取加入藥液培養(yǎng)48 h的細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液 Trizol,常規(guī)提取總RNA,并以核酸蛋白儀檢測(cè)其濃度。3項(xiàng)指標(biāo)均從各組取6個(gè)樣品孔進(jìn)行測(cè)定,取其平均值作為最終測(cè)定結(jié)果。常規(guī)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,收集cDNA樣品進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增所得產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外線識(shí)別條帶,經(jīng)凝膠成像分析軟件分析相對(duì)光密度,即“目的條帶光密度/ GAPDH條帶光密度”,以此作為目的基因的mRNA表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖抑制率聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率為(31.3±4.83)%,MTX組為(22.4±4.05)%,復(fù)方風(fēng)濕寧組為(21.6±4.12)%,各組細(xì)胞增殖抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=6.728,P<0.05),其中聯(lián)合組最高,MTX組和復(fù)方風(fēng)濕寧組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.2caspase-3、caspase-9和IL-22 mRNA表達(dá)水平各組患者的caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；其中caspase-3、caspase-9 mRNA表達(dá)水平以聯(lián)合組為最高,對(duì)照組為最低,MTX組和風(fēng)濕寧組之間無顯著差異(P>0.05)；IL-22 mRNA表達(dá)水平以聯(lián)合組為最低,對(duì)照組最高,MTX組和復(fù)方風(fēng)濕寧組之間無顯著差異(P>0.05),見表2、圖1。

表2　各組caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表達(dá)水平比較(n=6)

注:與對(duì)照組相比,①P<0.01；與聯(lián)合組相比,②P<0.01

圖1　各組caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA的RT-PCR凝膠電泳

3討論

FLS過度增生和局部炎性反應(yīng)是RA的兩大臨床病理特征,研究表明,RA發(fā)病過程中,FLS可由正常水平的1~3層細(xì)胞增至15 層以上；且增生的FLS具有類似腫瘤細(xì)胞的高侵襲性,凋亡反應(yīng)受到抑制,持續(xù)分泌大量基質(zhì)金屬蛋白酶,破壞軟骨組織[4]。caspase家族是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其中caspase-9主要介導(dǎo)凋亡反應(yīng)的初始階段,而caspase-3主要介導(dǎo)凋亡反應(yīng)的凋亡階段,故caspase-9和caspase-3可用以衡量凋亡反應(yīng)的整體活化狀態(tài)[5-6]。在RA發(fā)病過程中,除自身增生和破壞骨質(zhì)之外,FLS細(xì)胞還可分泌多種炎性介質(zhì)及趨化因子,募集免疫細(xì)胞及炎性細(xì)胞,促進(jìn)關(guān)節(jié)免疫炎性反應(yīng)。IL-22是IL-10細(xì)胞因子家族成員,為Th22細(xì)胞的主要效應(yīng)因子,高表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞。體外研究表明,Th22細(xì)胞誘導(dǎo)可成百倍地上調(diào)抗病原微生物趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11的表達(dá),對(duì)于具有抗菌、抗病毒作用的CCL2、CCL5及CCR6亦有顯著促進(jìn)作用,且該過程伴隨著IL-22的大量產(chǎn)生[7-8]。說明在免疫炎性反應(yīng)的激活中,IL-22發(fā)揮了舉足輕重的作用。

經(jīng)臨床證實(shí),MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧均為治療RA的有效藥物[9-10],但其藥理機(jī)制尚未完全明確。本研究重點(diǎn)探討MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧對(duì)RA滑膜成纖維細(xì)胞IL-22水平的影響。姚瑤等[11]研究表明,teriflunomide聯(lián)合MTX可以有效抑制 RAFLS增殖,防止骨質(zhì)破壞。本研究結(jié)果顯示,單純的MTX對(duì)RAFLS 增殖亦有抑制作用,但與復(fù)方風(fēng)濕寧聯(lián)合應(yīng)用時(shí),其抑制效能可得到顯著提高,說明二者有協(xié)同作用。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示,MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧均可提高RAFLS caspase-3、caspase-9 mRNA表達(dá)水平,說明激活凋亡通路,加速RAFLS凋亡進(jìn)程,可能為兩者發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用的重要機(jī)制。另外,本研究發(fā)現(xiàn),MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧均能降低RAFLS IL-22 mRNA表達(dá)水平,且聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果最佳。已有研究證實(shí)[12],IL-22 mRNA在RA患者的滑膜組織及滑膜單核細(xì)胞中的表達(dá)均有明顯上調(diào)。與此同時(shí),上調(diào)的IL-22可促進(jìn)纖維細(xì)胞膜表面的RANKL高表達(dá),加速破骨細(xì)胞生成。故IL-22可作為RA早期骨侵蝕的血清學(xué)標(biāo)志,預(yù)測(cè)發(fā)病程度。本研究結(jié)果說明,MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧均可抑制RAFLS和炎性因子IL-22的產(chǎn)生,但聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

綜上所述,RA患者的FLS凋亡反應(yīng)受到抑制,增生活動(dòng)亢進(jìn),同時(shí)伴隨IL-22的分泌和激活。MTX和復(fù)方風(fēng)濕寧均可上調(diào)細(xì)胞凋亡因子caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá),從而促進(jìn)凋亡,抑制RAFLS過度增生和IL-22過表達(dá)所導(dǎo)致的免疫炎性損傷,而兩藥聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

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(收稿日期:2014-11-24)

文章編號(hào)1004-0188(2015)03-0026-03

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.011

中圖分類號(hào)R 593.22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A