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胃炎口服液對Hp感染小鼠血清及胃黏膜細(xì)胞因子的影響

李莉，李衛(wèi)紅，江恒，敬新蓉，盧海波，馮懷志，孫薏

[摘要]目的研究胃炎口服液對幽門螺桿菌(Hp)感染小鼠血清IL-2、IL-8及胃黏膜IL-8和IFN-γ的影響，探討胃炎口服液治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎(HAG)的機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)小鼠被隨機(jī)分為4組：正常對照組(D組)、模型對照組(C組)、麗珠維三聯(lián)組(陽性對照，B組)和胃炎口服液組(A組)，每組15只。采用Hp菌液灌胃法制備Hp感染小鼠模型，D組用正常小鼠，后3組用模型小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。前兩組給予等體積的生理鹽水灌胃，后兩組分別用麗珠維三聯(lián)和胃炎口服液灌胃，均灌胃2 w。2 w后處死動(dòng)物，觀察各組小鼠胃黏膜病理學(xué)改變，ELISA檢測血清IL-2和IL-8的水平以及胃黏膜IL-8和IFN-γ的含量。結(jié)果與C組比較，胃炎口服液(A組)能顯著減輕HAG小鼠胃黏膜炎癥，降低血清和胃黏膜IL-8及胃黏膜IFN-γ的含量(P<0.05)，并提高血清IL-2的水平(P<0.05)，但其作用尚不及麗珠維三聯(lián)(B組)明顯。結(jié)論胃炎口服液能調(diào)節(jié)IL-2和IL-8、IFN-γ之間的失調(diào)，進(jìn)而對HAG有治療作用。

[關(guān)鍵詞]幽門螺桿菌；小鼠；胃炎口服液；IL-2；IL-8；IFN-γ

幽門螺桿菌(Hp)感染后發(fā)生的胃黏膜炎癥稱為幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎(HAG)。據(jù)調(diào)查，Hp在全世界范圍感染率超過50%，我國平均感染率為55%[1]。感染后患者很難自發(fā)清除，導(dǎo)致HAG的發(fā)生，其長期存在使得15%~20%患者出現(xiàn)消化性潰瘍[2]，部分可進(jìn)展為慢性萎縮性胃炎、胃癌等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。最近研究發(fā)現(xiàn)，白介素(IL)等免疫細(xì)胞因子參與了HAG發(fā)生與發(fā)展過程并發(fā)揮重要作用[3]，其二者的關(guān)系已是近來研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)階段兩種抗生素加質(zhì)子泵抑制劑三聯(lián)療法是治療Hp感染的常選方案[4]，但抗生素的不良反應(yīng)、Hp產(chǎn)生耐藥、治療費(fèi)用較高等因素影響了HAG的治療[5]。中藥具有毒副作用輕、發(fā)生耐藥低、腸道菌群失衡少等優(yōu)點(diǎn)，本研究探討了我院自制胃炎口服液對感染Hp小鼠致HAG相關(guān)細(xì)胞因子的作用，觀察了胃炎口服液對HAG的效果。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性昆明種小鼠65只，約7 w齡，約19 g/只。購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心(動(dòng)物合格證號：0003276)。在本院實(shí)驗(yàn)樓動(dòng)物科清潔級喂養(yǎng)，室溫(23±2)℃，相對濕度為(55±5)%，每天光照黑暗交替各12 h。自由飲水、進(jìn)食。

1.2主要試劑與儀器H.pylori(SS1)菌株由華西醫(yī)學(xué)中心饋贈(zèng)；Giemsa染液購自廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司，快速尿素酶試劑盒購于珠海市克迪科技開發(fā)公司，用于檢測血清指標(biāo)的小鼠ELISA試劑盒(IL-2和IL-8)購于武漢華美生物工程有限公司，用于測定胃黏膜指標(biāo)的小鼠ELISA試劑盒(IL-8和IFN-γ)購于聯(lián)科生物科技有限公司，麗珠維三聯(lián)組(枸櫞酸鉍鉀片/替硝唑片/克拉霉素片組合裝)購于麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，胃炎口服液由我院制劑室提供；自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(型號Model550，美國Bio Rad公司)。

1.3Hp感染小鼠模型的建立及分組參照文獻(xiàn)[6]方法，制備H.pylori菌液，采用H.pylori菌液灌胃法制備Hp感染小鼠模型，并檢查小鼠胃部Hp感染。

實(shí)驗(yàn)小鼠被隨機(jī)分為4組：正常對照組(D組)、模型對照組(C組)、麗珠維三聯(lián)組(陽性對照，B組)和胃炎口服液組(A組)，每組15只。B組用麗珠維三聯(lián)(每毫升含枸櫞酸鉍鉀7.8 mg、替硝唑6.5 mg及克拉霉素3.25 mg)液體灌胃，0.4 ml/(只·d)；A組用僅含胃炎口服液0.078 ml的灌胃液0.4 ml灌胃，0.4 ml/(只·d)；D組和C組用等體積生理鹽水灌胃；共2 w。

1.4取材與檢測小鼠最后一次給藥后，繼續(xù)飲水、禁食12 h，然后處死取血，常溫離心取上清液，按照試劑盒說明書用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定小鼠血清IL-8和IL-2的含量。剖腹取小鼠胃黏膜組織約450 mg，勻漿離心取上清液，同樣用ELISA法檢測小鼠胃黏膜IL-8和IFN-γ的含量。取胃組織切片，用蘇木素-伊紅染色，在光鏡下觀察胃黏膜的炎性程度，炎癥活動(dòng)程度計(jì)分方法見文獻(xiàn)[6]。

2結(jié)果

2.1模型制備情況經(jīng)尿素酶、Giesma染色和細(xì)菌學(xué)涂片等檢測，結(jié)果顯示本建模方法成功，Hp感染成功率100%。

2.2各組胃黏膜病變程度C組炎性程度最明顯，與A、B兩組對比均呈顯著性差異(P<0.05)；經(jīng)治療后，A、B兩組炎性程度明顯減輕，但B組效果優(yōu)于A組(P<0.05)，且與正常對照組D組無差別。見表1。

表1　各組胃黏膜病變程度(n=15)

注：與C組比較，①P<0.05；與A組比較，②P<0.05

2.3各組血清IL-2和IL-8的檢測結(jié)果C組IL-2含量明顯低于D組(P<0.05)，說明感染后，小鼠血清IL-2含量明顯減少；A和B兩組經(jīng)治療后血清IL-2較C組有顯著增高(P<0.05)。C組IL-8含量顯著高于D組(P<0.05)，說明感染后小鼠血清IL-8含量顯著升高；A組和B組血清IL-8含量經(jīng)治療后較C組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2　各組血清IL-2和IL-8的檢測結(jié)果比較(n=15)

注：與C組比較，①P<0.05

2.4各組小鼠胃黏膜IL-8和IFN-γ的檢測結(jié)果C組胃黏膜IL-8和IFN-γ含量均顯著高于D組(P<0.05)，說明小鼠感染后胃黏膜IL-8和IFN-γ含量均明顯增高；A、B兩組經(jīng)治療后，胃黏膜IL-8和IFN-γ含量均明顯較C組降低(P<0.05)，且B組治療效果較A組好(P<0.05)。見表3。

表3　各組小鼠胃黏膜IFN-γ和IL-8含量的比較(n=15)

注：與C組比較，①P<0.05;與A組比較，②P<0.05

3討論

研究藥物抗Hp所致疾病的前提是構(gòu)建價(jià)廉、穩(wěn)定并能真實(shí)地模擬人胃Hp感染的模型動(dòng)物，現(xiàn)常見的Hp的天然宿主動(dòng)物因價(jià)格高、來源少、飼養(yǎng)條件苛刻等原因而不宜用于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究[7]。而來源便利、屬系多樣的小鼠，因體型小、易繁殖，成為動(dòng)物模型的較好選擇[8]，適合用于構(gòu)建胃Hp感染動(dòng)物模型。

本研究結(jié)果提示，我院自制的胃炎口服液有顯著的治療HAG的作用(A組)，與常用的西醫(yī)三聯(lián)療法效果相近(B組)，并且對參與了HAG發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)免疫細(xì)胞因子(IL-2、IL-8及IFN-γ)有明顯改善作用。

胃黏膜感染Hp后，由于抗炎和促炎因子失衡，導(dǎo)致胃黏膜微環(huán)境改變，是引起Hp相關(guān)性胃病的主要原因之一。T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞克隆擴(kuò)增，提高GM-CSF功能，增強(qiáng)LAK、NK細(xì)胞、殺傷性T淋巴細(xì)胞等的殺傷活性，協(xié)同刺激B淋巴細(xì)胞增殖及抗體的產(chǎn)生，所以，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中處于至關(guān)重要的地位。機(jī)體免疫狀態(tài)可通過血清IL-2水平的高低體現(xiàn)[9]。研究顯示，Hp感染患者因Th1細(xì)胞的增殖活性低，使其分泌的IL-2水平也低，導(dǎo)致免疫功能低下。

IL-8是Hp感染后的重要炎性介質(zhì)之一，胃黏膜感染Hp后，IL-8的分泌增加，使得單核細(xì)胞等向受損部位趨化并激活，導(dǎo)致胃黏膜炎性反應(yīng)，這可能是Hp相關(guān)胃炎的始動(dòng)因素。研究顯示，Hp感染者IL-8的水平與炎癥程度呈正相關(guān)[10]。另外，Hp感染后，Th1免疫應(yīng)答導(dǎo)致胃黏膜分泌大量IFN-γ，使中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞的活性增強(qiáng)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子及炎癥遞質(zhì)等，導(dǎo)致胃黏膜上皮受損。因而，降低IFN-γ 水平有助于Hp感染相關(guān)炎癥的控制[3]。

胃炎口服液是復(fù)方中成藥，對常見的胃部疾患有較好療效?？擅黠@降低Hp感染后所致的血清和胃黏膜IL-8升高，降低胃黏膜IFN-γ水平，以及增高血清IL-2水平。其主要原因可能與胃炎口服液的一些重要組分有關(guān)。茯苓、南沙參、丹參和黃芩等中藥是胃炎口服液的主要成分，其中多味中藥都具有免疫調(diào)節(jié)作用，如南沙參、黃芩和茯苓等。它們可增強(qiáng)小鼠的免疫功能，激發(fā)胃腸道的免疫系統(tǒng)，平衡抗炎和促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而保護(hù)胃腸道，抵御Hp對胃黏膜的侵害[11-12]。

綜上所述，胃炎口服液能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，糾正細(xì)胞因子失衡，減輕炎性反應(yīng)，提高機(jī)體免疫，緩解Hp感染后所致胃炎。其治療效果與常用的西醫(yī)三聯(lián)療法效果相近，并為純中藥制劑，不易耐藥、副作用小，有較好的應(yīng)用前景。

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Effect of Gastritis Oral Liquid on serum and gastric mucosal cytokines of mice with Hp infection

Li Li1,Li Weihong2,Jiang Heng1,Jing Xinrong1,Lu Haibo1,Feng Huaizhi1,Sun Yi11.Department of Oncology,Hospital 452 of PLA,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Medial Squadron,Logistics Department,Sichuan Provincial Military Command,Chengdu,Sichuan,610000,China

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of Gastritis Oral Liquid on serum IL-2 and IL-8 as well as gastric mucosal cytokines IL-8 and IFN-γ of mice withHelicobacterpylori(Hp)infection,and explore the mechanism of Gastritis Oral Liquid in the treatment ofHelicobacterpylori-associated gastritis(HAG).MethodsKunming mice models infected by human Hp were built by intragastric Hp administration.All the mice were randomly divided into 4 groups:normal control group(group D),model control group(group C),Lizhuwei Sanlian group(positive group,group B),and Gastritis Oral Liquid group(group A;n=15 per group).They were treated with:group A:Gastritis Oral Liquid;group B:Lizhuwei Sanlian;group C:normal saline;group D:normal saline.The treatments were carried out once a day for 2 weeks for each group,and then these mice were killed in order to observe the pathological changes of the mice's gastric mucosa and detect the serum levels of IL-2 and IL-8 and contents of gastric mucosal cytokines IL-8 and IFN-γ by ELISA.ResultsCompared with group C,Gastritis Oral Liquid reduced significantly the HAG mice gastric mucosa inflammation,reduced the serum levels of IL-8 and contents of gastric mucosal cytokines IL-8 and IFN-γ(P<0.05),and increased the serum levels of IL-2(P<0.05).But the effects of Gastritis Oral Liquid was less than that of Lizhuwei Sanlian.ConclusionGastritis Oral Liquid may play a protective effect on the gastric mucosa in HAG mice through adjusting the balance of cytokine network,maintaining the balance between the anti-inflammatory cytokines(IL-2)and pro-inflammatory cytokines(IL-8 and INF-γ).

[Key words]Helicobacterpylori;mouse;Gastritis Oral Liquid;IL-2;IL-8;IFN-γ

(收稿日期:2015-01-14)

文章編號1004-0188(2015)02-0129-03

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.02.006

中圖分類號R 285.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

通訊作者:孫薏，E-mail:yi_sun307@yahoo.com.cn

基金項(xiàng)目:成都軍區(qū)十二五重點(diǎn)項(xiàng)目(B12011)
作者單位:610021 成都，解放軍452醫(yī)院腫瘤科(李莉，江恒，敬新蓉，盧海波，馮懷志，孫薏)；四川省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生所(李衛(wèi)紅)