肖龍泉，任亞碩，吳德玲，汪天明

(1.安徽省亳州市人民醫(yī)院，安徽 亳州　236804；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230038；

3.安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥　230038)

?

紫外分光光度法測定醉魚草果實中總黃酮含量

肖龍泉1，任亞碩2,3，吳德玲2,3，汪天明2,3

(1.安徽省亳州市人民醫(yī)院，安徽 亳州236804；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230038；

3.安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥230038)

摘要:目的建立醉魚草果實中總黃酮的含量測定方法。方法采用紫外分光光度法，以蘆丁為對照品，通過亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉系統(tǒng)顯色法測定醉魚草果實中總黃酮的含量。結(jié)果蘆丁在8.56~51.36 mg·L-1范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系(A=0.012 0C-0.007 1，r=0.999 8)，平均加樣回收率為98.76%，相對標準偏差為1.74%(n=6)，所測得醉魚草果實中總黃酮含量為5.29%。結(jié)論該方法操作快速、簡便，結(jié)果準確可靠，可用于醉魚草果實中總黃酮成分的含量測定。

關(guān)鍵詞:醉魚草果實；總黃酮；紫外分光光度法；含量測定

醉魚草果實藥材是馬錢科植物醉魚草(BuddlejalindleyanaFort.)的果實，具有祛風(fēng)除濕、止咳化痰、散瘀之功效[1]。文獻報道醉魚草屬植物中含有豐富的化合物種類，包括黃酮類，三萜類及苯乙醇苷類等[2-5]，其中黃酮類成分，具有多種藥理活性[6-7]。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，醉魚草果實中同樣含有豐富的黃酮類化合物[8]，主要為蘆丁、槲皮素、木犀草素等，是其主要藥理活性成分，其中蘆丁是一種脫氫黃素酮的糖苷，在各類植物中普遍存在，且含量較高。醉魚草果實中黃酮類含量的測定方法未見報道，為了進一步研究醉魚草果實中的黃酮類成分，本研究選用蘆丁作為對照品，通過經(jīng)典的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[9-10]，建立了醉魚草果實中黃酮類成分的含量測定方法。

1儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(UV-757CRT型，上海精科)；電子分析天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇市國勝實驗儀器廠)；高速中藥粉碎機(FZ-02，浙江省溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠)。蘆丁對照品(批號：100080-200306：中國藥品生物制品檢定所)；醉魚草果實(于2008年12月采自安徽舒城萬佛山，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為馬錢科植物醉魚草的果實)；亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，甲醇等均為分析純；水(實驗室自制超純水)。

2方法及結(jié)果

2.1對照品及供試品溶液的制備精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h蘆丁對照品10.7 mg，置50 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容至刻度即得；蘆丁對照品溶液濃度為0.214 g·mL-1。精密稱取醉魚草果實粗粉1 g，置50 mL圓底燒瓶中，加甲醇20 mL回流提取提取3次，每次1 h，合并濾液，并定容至100 mL，即得供試品溶液。

2.2檢測吸收波長的確定分別精密吸取上述對照品溶液6.0 mL、供試品溶液3.0 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，再加入5%的NaNO2溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；加10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；加4%NaOH溶液10 mL，加水定容至刻度，搖勻后靜置15 min。紫外—可見分光光度儀全波長掃描的結(jié)果顯示，對照品及供試品溶液在510 nm波長處顯示有較強吸收峰，因此選定510 nm作為檢測波長，見圖1。

注：(a)和供試品溶液(b)紫外掃描圖。

2.3標準曲線的建立分別精密吸取蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，均加入蒸餾水至6 mL，按“2.2”項下步驟操作，以第一份作為空白對照，在510 nm處測定各對照品溶液的吸光度值。吸光度值分別為0.099,0.195,0.301,0.404,0.505,0.612。以吸光度值(A)為縱坐標，蘆丁對照品溶液濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為：A=0.012 0C- 0.007 1 (r=0.999 8)，結(jié)果表明蘆丁在8.56~51.36 mg·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4精密度考察精密吸取同一供試品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2”步驟中的方法顯色，重復(fù)測定6次，吸光度值分別為：0.247,0.246,0.246,0.245,0.248,0.247。計算其吸光度值的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)=0.43%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性考察分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2”步驟操作，測定吸光度，每隔5 min測定一次，連續(xù)25 min，考察其顯色穩(wěn)定性。吸光度值分別為：0.247,0.245,0.245,0.241,0.243,0.242。結(jié)果表明，供試品及對照品溶液在顯色系統(tǒng)完全反應(yīng)后25 min內(nèi)，具有良好穩(wěn)定性。

2.6重復(fù)性考察分別精密稱取醉魚草果實粗粉1 g，共6份，按“2.2”步驟制備供試品溶液并測定其吸光度，吸光度值分別為：0.251,0.242,0.249,0.255,0.245,0.243。計算得藥材中總黃酮含量平均值為5.29%，RSD=1.83%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗分別精密吸取含量已知的醉魚草果實供試品溶液1 mL，6份，置于25 mL容量瓶中，各加入蘆丁對照品溶液2.5 mL，按“2.2”步驟，測定吸光度，計算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表1，表明本方法結(jié)果準確可靠。

表1　加樣回收率試驗

2.8樣品含量測定精密稱取醉魚草果實粗粉1 g，甲醇回流提取3次，每次1 h，濾液合并后，用甲醇定容至100 mL容量瓶，平行測定3組，按“2.2”步驟顯色并測定吸光度，計算得供試品中總黃酮含量分別為5.28%、5.32%、5.41%，平均含量為5.34%。

3討論

3.1供試品的提取醉魚草果實含多種黃酮類化合物，黃酮類化合物的提取實驗前期分別采用純水、不同濃度的乙醇及甲醇作為提取溶媒，考察醉魚草果實中總黃酮含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇回流提取時，所測得藥材中總黃酮含量最高[11]，進而選定甲醇為醉魚草果實藥材的提取溶劑。

3.2測定方法的確定黃酮成分的分析測定方法主要包括薄層掃描法、HPLC法、紫外分光光度法等。波層掃描法測定醉魚草果實中總黃酮的影響因素太多，測定結(jié)果不理想。總黃酮中成分種類較多，通過HPLC法測定每個黃酮成分的含量，來測定總黃酮的含量也并不現(xiàn)實。醉魚草果實中黃酮類化合物的紫外區(qū)間的吸光度值雖不一致，但其黃酮母核能與亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉系統(tǒng)反應(yīng)，通過被亞硝酸鈉還原，再加硝酸鋁絡(luò)合，在堿性條件下顯紅色，在510 nm處有較強吸收，吸收峰穩(wěn)定無干擾，根據(jù)顯色后吸光度的不同，可實現(xiàn)對其黃酮類成分的測定，既能有效避開其他成分對黃酮測定的影響，又能保證結(jié)果的準確性[12]。在實驗中還發(fā)現(xiàn)，顯色反應(yīng)會隨著顯色溫度和顯色時間的變化而變化，25 min內(nèi)變化較緩，25 min后其吸光度值會下降，因此實驗過程中應(yīng)嚴格控制條件，盡量排除干擾。

本文以蘆丁為對照品，采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉法，測定醉魚草果實中黃酮類成分的總含量，結(jié)果顯示該法操作快速、簡便，結(jié)果準確可靠，可作為醉魚草果實總黃酮的含量測定方法。

3.3應(yīng)用前景醉魚草作為中醫(yī)的傳統(tǒng)藥材，但其果實的研究較少，這不利用醉魚草資源的綜合開發(fā)，本研究通過紫外分光光度法測定醉魚草果實中總黃酮含量，建立了醉魚草果實總黃酮的含量測定方法，為醉魚草這一傳統(tǒng)藥用資源的綜合利用提供了參考依據(jù)。

參考文獻：

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典(下冊)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986: 1128-1129.

[2]彭雪晶，李沖．大葉醉魚草黃酮類成分研究[J]．中藥材，2011,34(10): 1534-1537.

[3]吳德玲，汪洋奎，王訓(xùn)翠，等．醉魚草果實三萜類成分及其活性研究[J].中藥材，2011,34(12):1884-1887.

[4]Wu DL,Wang YK,Liu JS,et al.Two new compounds from the fruits of Buddleja lindleyana with neuroprotective effect[J].J Asian Nat Prod Res,2012,14(4): 342-347.

[5]Tai BH,Nhiem NX,Quang TH,et al.A new iridoid and effect on the rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation of isolated compounds from Buddleja officinalis [J].Bio & Med Chem Let,2011,21: 3462-3466.

[6]蔡凌云，韓素菊，肖杭，等．密蒙花總黃酮抗氧化活性[J]．光譜實驗室， 2011,28(3): 1343-1346.

[7]王方，彭清華，姚小磊，等．密蒙花總黃酮含藥血漿干預(yù)干眼癥細胞凋亡模型AR mRNA表達[J]．國際眼科雜志，2011,11(2): 220-222.

[8]吳德玲，汪洋奎，劉勁松．醉魚草果實的化學(xué)成分研究(Ⅱ)[J]．中成藥，2011,33(12): 2107-2109.

[9]李莉，孫穎平，李思棟，等．黑果小檗總黃酮含量測定及體外抗氧化活性研究[J]．安徽醫(yī)藥，2013,17(6): 934-936.

[10] 黨曉芳，曹颯麗，祁娟娟．鬼箭羽總黃酮含量測定方法的建立[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2014,20(9): 96-98.

[11] 沈炳香,吳德玲,任亞碩,等.正交設(shè)計優(yōu)選醉魚草果實總?cè)铺崛」に嘯J]．安徽醫(yī)藥，2013,17(2): 186-188.

[12] 周麗,張睿,馬燕,等.紅旱蓮總黃酮的含量分析[J].安徽醫(yī)藥,2009,13(12): 1494-1495.

Determination of flavonoids in the fruits of

BuddlejalindleyanaFort.by ultraviolet spectrophotometry

XIAO Long-quan1,3,REN Ya-shuo2,3,WU De-ling2,3,et al

(1.ThePeople’sHospitalofBozhou,Anhui236804,China;2.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityof

TraditionalChineseMedicine,Anhui,Hefei230038,China;3.AnhuiKeyLaboratoryofModernized

ChineseMaterial,Hefei,Anhui230038,China)

Abstract:ObjectiveToestablishamethodfordeterminingtotalflavonoidsinthefruitofBuddleja lindleyanaFort.MethodsThecontentoftotalflavonoidswasdetectedbyultravioletspectrophotometry(US) .Itwasperformedonrutin(asacontrol)andasamplewithsodiumnitrite-aluminumnitrateandsodiumhydroxideascolor-developingagent.ResultsThegoodlinearitybetweenconcentrationsandabsorbanceofrutinwasfoundwithintherangeof8.56to51.36mg·L-1(A=0.012 0 C-0.007 1，r=0.999 8).Theaveragerecoverywas98.76%andrelativestandarddeviationwas1.74% (n=6).ThefruitofBuddleja lindleyanaFort.contained5.29%oftotalflavonoids.ConclusionsThismethodcanbeusedfordeterminingflavonoidsinthefruitofBuddleja lindleyanaFort.becauseofitsrapidness,simplicity,accuratenessandreliability.

Keywords:fruitsofBuddleja lindleyanaFort.;totalflavonoids;ultravioletspectrophotometry;contentdetermination

(收稿日期：2014-02-11，修回日期：2014-05-27)

通信作者：吳德玲，男，教授，研究方向： 中藥活性成分研究，E-mail:dlwu7375@sina.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No81373841)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點項目(NoKJ2013A170)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.017