肖　丹，鐘選芳，許岸高

(惠州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 惠州 516001)

?

APC、p53、K-ras在結(jié)直腸腫瘤檢測中的研究價值

肖丹，鐘選芳，許岸高※

(惠州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 惠州 516001)

摘要：目的采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)銀染法檢測腺瘤多發(fā)性息肉病(APC)、p53、K-ras三個基因在結(jié)直腸腫瘤篩查中的敏感性和特異性。方法選擇2011年11月至2012年8月惠州市第一人民醫(yī)院消化門診收治的14例結(jié)直腸癌(CRC組)，60例結(jié)直腸腺瘤(CRA組)，30例正常組糞便標本，提取DNA，PCR-SSCP銀染法檢測基因突變。結(jié)果APC、p53、K-ras三個基因聯(lián)合檢測在CRC組、CRA組、正常組突變率分別為57.1%(8/14)、30.0%(18/60)、3.3%(1/30)；在結(jié)直腸腫瘤的靈敏度和特異度分別為35.1%(26/74)、96.7%(29/30)，糞便DNA聯(lián)合檢測CRC組、CRA組的檢出率高于正常組(均P<0.05)。結(jié)論糞便DNA聯(lián)合檢測在無創(chuàng)性篩查結(jié)直腸腫瘤中具有可行性，可能是一種適合于結(jié)直腸腫瘤篩查的無創(chuàng)性方法和篩查模式。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸腫瘤；糞便DNA；聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性；腺瘤多發(fā)性息肉病基因；p53；K-ras

糞便DNA檢測是目前除糞便隱血試驗以外唯一非侵入性檢查方法，用于結(jié)直腸腫瘤的篩查,是近年來的研究熱點。目前認為93%的結(jié)直腸癌來源于結(jié)直腸腺瘤，從腺瘤發(fā)展成癌需3～17年，此自然病程為結(jié)直腸腫瘤的篩查發(fā)現(xiàn)癌前病變提供了時間基礎(chǔ)[1]。近年來，結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病率和病死率有逐年上升的趨勢，而篩查可降低結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病率和病死率[2]。目前，亟需一種人群依從性高、敏感性和特異性高的檢測方法應(yīng)用于臨床推廣。本研究主要探討糞便DNA檢測在結(jié)直腸腫瘤篩查中的研究價值。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2011年11月至2012年8月惠州市第一人民醫(yī)院消化門診收治的14例結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)組，60例結(jié)直腸腺瘤(colorectal adenoma，CRA)組，30例正常組糞便標本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者在檢查前均先簽署知情同意書。

1.2納入、排除標準納入標準[3]：①主動到醫(yī)院進行健康體檢的個體。②有結(jié)直腸癌高危因素的個體，包括年齡50 歲以上；潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病不愈10年以上；既往有結(jié)直腸癌病史或結(jié)直腸腺瘤史；膽管疾患及膽囊切除10年以上；下腹部放療史10年以上；結(jié)腸慢性血吸蟲病史；慢性闌尾炎病史；一級親屬患有結(jié)直腸癌者，年齡≥親屬結(jié)直腸癌診斷年齡-10歲(即比患結(jié)直腸癌者年輕10歲的一級親屬為高危人群)；遺傳性非腺瘤性結(jié)腸癌家系的成員，年齡≥10歲；一級親屬有家族性息肉病者，年齡≥10歲。排除標準：①非自愿參與的患者。②結(jié)直腸腫瘤癥狀的患者：腹痛、黏液血便、排便習慣改變。③已確診為“結(jié)直腸癌” 或“結(jié)直腸息肉”的患者。以上所有標本均為新鮮標本-80 ℃保存，診斷結(jié)果均經(jīng)病理證實。以全結(jié)腸鏡檢查(型號Japan Olympus CF260)和病理組織學檢查為診斷大腸腫瘤的金標準，糞便和組織DNA檢測及結(jié)腸檢查均采用盲法進行。

1.3方法采用TIANgen生物有限公司糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA，上海英駿生物公司設(shè)計并合成引物(表1)，采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(ploymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism，PCR-SSCP)銀染法檢測腺瘤多發(fā)性息肉病(adenomatous polyposis,APC)、p53、K-ras基因突變，以某一基因單鏈條帶位置改變與正常組織相比超過3 mm以上，或出現(xiàn)異常條帶，則視為有突變。了解糞便DNA在結(jié)直腸腫瘤檢測中的突變情況。

1.4統(tǒng)計學方法用EpiData 3.1建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1APC基因、p53基因和K-ras基因在CRC組、CRA組、正常組中的突變差異APC基因在CRC組、CRA組、正常組的突變率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在CRC組的靈敏度為21.4%(3/11)，特異度為85.6%(77/90)；結(jié)直腸腫瘤的靈敏度為20.3%(15/74)，特異度為96.7%(29/30)。見表2。

表1　APC、p53、K-ras基因引物序列及PCR產(chǎn)物片段長度

APC:腺瘤多發(fā)性息肉病;PCR:聚合酶鏈反應(yīng)

p53基因在CRC組、CRA組、正常組的突變率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CRC組、CRA組均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.296，8.289，均P<0.05)。在CRC組的靈敏度為50.0%(7/14)，特異度為84.4%(76/90)；在結(jié)直腸腫瘤中的靈敏度為28.4%(21/74)，特異度為100.0%(30/30)。見表2。

K-ras基因CRC組、CRA組、正常組的突變率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CRC組、CRA組均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.887，5.625，均P<0.05)。在CRC組的靈敏度為42.9%(6/14)，特異度為88.9%(80/90)；在結(jié)直腸腫瘤中的靈敏度為21.6%(16/74)，特異度為100.0%(30/30)。見表2。

2.2APC基因、p53基因和K-ras基因聯(lián)合檢測在CRC組、CRA組、正常組中的突變差異三個基因聯(lián)合檢測在CRC組、CRA組、正常組的突變率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，糞便DNA聯(lián)合檢測CRC、CRA的突變率均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.840，8.540，均P<0.05)。糞便DNA聯(lián)合檢測CRC的靈敏度為57.1%(8/14)，特異度為78.9%(71/90)；糞便DNA聯(lián)合檢測結(jié)直腸腫瘤的靈敏度為35.1%(26/74)，特異度為96.67%(29/30)。見表2。

表2　DNA單獨與聯(lián)合檢測在CRC組、CRA組、正常組的檢出率比較

CRC：結(jié)直腸癌；CRA：結(jié)直腸腺瘤；APC：腺瘤多發(fā)性息肉?。籥與正常組比較，P<0.05;b與CRA組比較，P<0.05

2.3基因測序結(jié)果用PCR-SSCP銀染法檢測發(fā)現(xiàn)，突變的APC、p53、K-ras基因與基因測序結(jié)果一致率為100.0%(圖1)。APC電泳突變分析顯示,5、6號為電泳有突變的標本(圖2A)，K-ras中8、9號為電泳有突變的標本(圖2B)，p53中2、3號為電泳有突變的標本(圖2C)，余為未見電泳突變的標本。

圖1　基因測序結(jié)果

圖2　APC 1061del、K-ras exon3 和p53 exon6在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳突變分析(29∶1)　2A：APC 1061del;2B：K-ras exon3;2C：p53 exon6; N：正常標本；A：腺瘤標本；T：癌標本

3討論

結(jié)腸鏡及病理組織學檢查是診斷腸道疾病的金標準，但結(jié)腸鏡為侵入性的有創(chuàng)檢查，較多的患者因害怕而拒絕行結(jié)腸鏡進一步檢查[4]，從而錯失了發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤早期病變的最佳時機。CRC是一個多基因、多階段、多步驟的的發(fā)生過程，自1992年首例CRC的糞便DNA檢測到基因突變[5]，有研究認為[6]，無創(chuàng)性基因檢測篩查CRC是具有遠大前景的篩查方法，Hsieh等[7]認為糞便DNA突變的檢測對結(jié)直腸癌的臨床病理特征和預(yù)后有一定影響，糞便DNA檢測CRC的基因突現(xiàn)已成為無創(chuàng)性檢測結(jié)直腸腫瘤的研究熱點。本研究采用PCR-SSCP銀染法聯(lián)合檢測與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生較密切的APC、p53和K-ras基因，探討糞便DNA檢測在結(jié)直腸腫瘤中的應(yīng)用價值。

APC基因是公認的結(jié)直腸癌管家基因，Abdul Murad等[8]應(yīng)用PCR-SSCP法檢測發(fā)現(xiàn)APC基因的突變率為35.89%；李琛等[9]應(yīng)用高分辨熔解曲線法檢測CRC中APC的突變率為41.90%，CRA中為25.00%。綜合上述文獻可知，APC基因在CRC中的突變率為36.1%～62.2%，CRA的突變率為20.0%～25.0%。本研究中APC在CRC組的突變率為21.4%，低于上述文獻報道[8-9]，可能原因為APC突變與CRC的臨床分期有關(guān)，因各個研究所選標本的Dukes分期不盡相同而結(jié)果有所差異。

p53基因是目前發(fā)現(xiàn)人類腫瘤相關(guān)性最強的抑癌基因，在進展性腺瘤發(fā)展成腺癌的過程中，p53基因發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要發(fā)生在CRC的晚期階段[5]。李琛等[9]檢測到CRC p53的突變率為54.80%，CRA p53的突變率為46.40%；Bazan等[10]用PCR-SSCP法檢測p53基因在CRC組中的突變率為43.00%。綜上可知，p53基因在CRC中的突變率為43.00%～54.80%，在CRA的突變率在0%～46.40%。本研究中p53基因在CRC組的基因突變率為50.0%，CRA組為23.3%，與以上報道相符合[9-10]。

K-ras基因是原癌基因，主要發(fā)生在腫瘤的早期。Sidransky等[5]首次在9例結(jié)直腸腫瘤糞便中檢測出8例K-ras基因突變，突變率為88.89%；李琛等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CRC組 K-ras的基因突變率為35.50%，CRA組為14.30%；Bazan等[10]檢測K-ras基因在CRC組中的突變率為46.00%。綜上可知，K-ras基因在CRC組中的突變率為35.50%～88.89%，CRA組約14.30%。本研究中K-ras 在CRC組的基因突變率為42.9%，CRA組為16.7%，與上述文獻報道相符合[9-10]，進一步證明了K-ras基因檢測可用于篩查結(jié)直腸腫瘤，糞便DNA檢測結(jié)直腸腫瘤具有良好的應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果還顯示，APC、p53、K-ras三個基因聯(lián)合檢測在CRC組的突變率為57.1%、CRA組為30.0%，糞便DNA聯(lián)合檢測結(jié)直腸腫瘤的靈敏度為35.1%，與Imperiale 等[11]報道糞便DNA聯(lián)合檢測對篩查結(jié)直腸癌具有較高的靈敏度和特異度一致，可能是更適合于結(jié)直腸腫瘤篩查的無創(chuàng)性方法。

PCR-SSCP銀染法檢測基因突變具有快捷、靈敏度高、特異性高等優(yōu)點，它能檢測癌標本中微小的變異，檢測大量標本時可用SSCP先篩選出異?；?，適用于大樣本的篩查，Abdul Murad 等[8]應(yīng)用PCR-SSCP篩查結(jié)直腸腫瘤，發(fā)現(xiàn)可降低結(jié)直腸腫瘤的病死率。Jin等[12]利用PCR-SSCP檢測糞便DNA，在結(jié)腸鏡檢測正常的患者中未發(fā)現(xiàn)有基因突變，而在腺瘤中K-ras的突變率為10%，在CRC組的突變率為11.2%，與組織DNA的檢測突變率是一致的。因此，PCR-SSCP 聯(lián)合檢測APC、p53、K-ras，操作可行性強，敏感性、特異性高，可為糞便DNA檢測在結(jié)直腸腫瘤篩查中的應(yīng)用開辟新的途徑。

參考文獻

[1]Siegel R,Desantis C,Jemal A.Colorectal cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2014，64(2):104-117.

[2]Sharp L,Tilson L,Whyte S,etal.Cost-effectiveness of population-based screening for colorectal cancer:a comparison of guaiac-based faecal occult blood testing,faecal immunochemical testing and flexible sigmoidoscopy[J].Br J Cancer,2012,106(5):805-816.

[3]許岸高.大腸癌高危分級篩查方案的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學雜志,2009,89(48)：3385-3387.

[4]鄧尚新,蔡全才,安薇,等.結(jié)直腸癌篩查依從性影響因素定性研究的系統(tǒng)評價[J].中華醫(yī)學雜志,2010,9(38):2679-2683.

[5]Sidransky D,Tokino T,Hamilton SR,etal.Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumours[J].Science,1992,256(5053):102-105.

[6]韓英,李世榮.應(yīng)倡導結(jié)直腸腫瘤的伺機性篩查[J].中華內(nèi)科雜志,2008,47(9):725-726.

[7]Hsieh JS,Lin SR,Chang MY,etal.APC,K-ras,and p53 gene mutations in colorectal cancer patients:correlation to clinicopathologic features and postoperative surveillance[J].Am Surg,2005,71(4):336-343.

[8]Abdul Murad NA,Othman Z,Khalid M,etal.Missense mutations in MLH1,MSH2,KRAS,and APC genes in colorectal cancer patients in Malaysia[J].Dig Dis Sci,2012,57(11):2863-2872.

[9]李琛,王新穎,許岸高,等.高分辨率熔解曲線分析在結(jié)直腸癌篩查中的應(yīng)用[J].廣東醫(yī)學,2011,32(1):10-13.

[10]Bazan V,Agnese V,Corsale S,etal.Specific TP53 and/or Ki-ras mutations as independent predictors of clinical outcome in sporadic colorectal adenocarcinomas:results of a 5-year Gruppo Oncologico dell′Italia Meridionale(GOIM) prospective study[J].Ann Oncol,2005,16(Suppl 4):iv50-55.

[11]Imperiale TF,Ransohoff DF,Itzkowitz SH,etal.Gastroenterology,Feacal DNA versus fecal occult blood for colorectal-cancer screening in an average-risk population[J].N Engl J Med,2004,351(26):2704-2714.

[12]Jin YM,Li BJ,Qu B,etal.BRAF,K-ras and BAT26 mutations in colorectal polyps and stool[J].World J Gastroenterol,2006,12(32):5148-5152.

The Value of APC,p53,K-ras DNA Detection in Colorectal Cancer Screening StudyXIAODan,ZHONGXuan-fang,XUAn-gao.(DepartmentofGastroenterology,HuizhouFirstPeople′sHospital,Huizhou516001,China)

Abstract：ObjectiveTo detect the sensitivity and specificity of gene adenomatous polyposis (APC),p53,K-ras genetic mutations in colorectal neoplasm using the ploymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism(PCR-SSCP) silver staining.MethodsSamples were enrolled from individuals who came to Huizhou First People′s Hospital Gastroenterology Clinic from Nov.2011 to Aug.2012:14 cases of colorectal cancer(CRC group),60 cases of colorectal adenomas(CRA group),30 cases of normal stool specimens,DNA was extrated,PCR-SSCP silver staining was used to detect genetic mutations.ResultsThe mutation rates of three genes APC,p53,K-ras detection in CRC,CRA and normal group were 57.1%(8/14),30.0%(18/60) and 3.3%(1/30) respectively.The sensitivity and specificity of three genes detection colorectal neoplasm were 35.1%(26/74)and 96.7%(29/30).The detection rate of three genes in CRC and CRA group were significantly higher than normal group(allP<0.05).ConclusionStool DNA detection is a feasibile non-invasive method for screening colorectal neoplasm,which might be a suitable non-invasive method for screening colorectal neoplasia.

Key words:Colorectal neoplasm; Stool DNA; Ploymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism; Adenomatous polyposis; p53; K-ras

收稿日期：2014-08-18修回日期：2015-05-10編輯：伊姍

基金項目：廣東省醫(yī)學科研究課題(B2011340)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.044

中圖分類號：R574.6

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)21-3969-03