金 婷

(棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東棗莊 277160)

芡實(shí)是睡蓮科植物芡的干燥成熟種仁，本試驗(yàn)以芡實(shí)中的多糖為研究對象，考察其萃取方法及工藝條件，從而為進(jìn)一步全面開發(fā)芡實(shí)中多糖成分提供科學(xué)依據(jù)。芡實(shí)多糖的分離提取技術(shù)目前多為熱水浸提法，并取得一定進(jìn)展，而雙水相萃取較為少見。傳統(tǒng)的多糖分離技術(shù)存在許多弊端，如可能破壞營養(yǎng)成分、提取率低等，不利于后續(xù)的純化及作用機(jī)理的研究，盡可能地保持其原有特性則可克服這一弊端，利用雙水相分離技術(shù)可達(dá)到這一目的［5-10］。本試驗(yàn)研究目的在于采用一種溫和的多糖提取技術(shù)提取芡實(shí)多糖，減少對其成分破壞［11］，并可在工業(yè)生產(chǎn)中采用該種分離技術(shù)，以達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)。

1 材料與儀器

1.1 原料試劑

芡實(shí) (市售成品);聚乙二醇 (PEG，分子量2 000、4 000、6 000、8 000)、硫酸銨、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖，均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

722N 可見光分光光度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鄭州長城科工貿(mào)有限公司;DHG-9141A 型電熱恒溫干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 芡實(shí)提取液的制備

稱取10g 市售芡實(shí)，經(jīng)研缽碾碎后置于燒杯中，加200mL 蒸餾水，煮沸30min，同時(shí)不停攪拌，多次過濾后定容至500mL 待用。

2.2 試驗(yàn)流程

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線→芡實(shí)多糖提取液制備→探究適宜PEG 相對分子質(zhì)量→探究適宜硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)→探究適宜PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)→正交試驗(yàn)→驗(yàn)證試驗(yàn)→試驗(yàn)結(jié)果分析。

2.3 多糖測定方法

蒽酮—硫酸法［12］。

2.4 單因素試驗(yàn)

分別單獨(dú)考察PEG 分子量、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)3 個(gè)因素對多糖提取率的影響。

2.5 正交試驗(yàn)

以上述3 組單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)定三因素三水平正交試驗(yàn)，以得出最佳條件組合。

2.6 相關(guān)計(jì)算公式［13］

(1)式中，K 為多糖在兩相體系中的分配系數(shù);R為上下相體積之比;Y 為多糖在上相中的收率;Ca為上相中多糖質(zhì)量濃度(mg/mL);Cb為下相中多糖質(zhì)量濃度(mg/mL);V上為上相體積(mL);V下為下相體積(mL)。

3 結(jié)果及分析

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 PEG 分子量選擇試驗(yàn)結(jié)果分析

按照表1 所示加入藥品，選取對照組，對照組用蒸餾水替換芡實(shí)多糖提取液。攪拌使其溶解后置于分液漏斗中靜置20min，分相完全后倒入不同量筒中，測其體積，記數(shù)。

表1 各分子量PEG 的加入量

上下相中各取1mL 加9mL 蒸餾水稀釋，再取1mL試液，分別加入蒽酮試劑4.0mL，沸水浴中加熱10min，用流水冷卻至室溫，在620nm 處測其吸光值。

由圖2、圖3 可以看出，上下相體積之比R 隨PEG相對分子量增大有所增大，但總體變化不明顯。多糖分配系數(shù)K 和收率Y 隨PEG 相對分子量增大呈先增后減，在PEG6000 時(shí)達(dá)到最大。結(jié)果顯示，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，PEG 分子量在6 000 時(shí)利于上相富集多糖，收率達(dá)54%。

圖2 分配系數(shù)K 及上下相體積之比R 與PEG 相對分子質(zhì)量的關(guān)系

圖3 收率Y 與PEG 相對分子質(zhì)量的關(guān)系

3.2.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)探究試驗(yàn)結(jié)果分析

按表2 所示加入藥品，選取對照組，對照組用蒸餾水替換多糖提取液。攪拌使其溶解后置于分液漏斗中靜置20min，分相完全后倒入不同量筒中，測其體積，記數(shù)。

上下相中各取1mL 加9mL 蒸餾水稀釋，再取1mL試液，分別加入蒽酮試劑4.0mL，沸水浴中加熱10min，用流水冷卻至室溫，在620nm 處測其吸光值。

由圖4、圖5 可以看出，上下相體積之比R 隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而減小，總體變化幅度不明顯。分配系數(shù)呈先增后減趨勢，在硫酸銨分?jǐn)?shù)20.6%時(shí)收率Y 達(dá)最大，達(dá)58%。結(jié)果顯示，選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.6%時(shí)利于上相富集多糖。

表2 硫酸銨的加入量

圖4 分配系數(shù)K 及上下相之比R 與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

圖5 收率Y 與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

3.2.3 PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)探究試驗(yàn)結(jié)果分析

按照表3 所示加入藥品，選取對照組，對照組用蒸餾水替換多糖提取液。攪拌使其溶解后置于分液漏斗中靜置20min，分相完全后倒入不同量筒中，測其體積，記數(shù)。

表3 PEG6000 的加入量

上下相中各取1mL 加9mL 蒸餾水稀釋，再取1mL試液，分別加入蒽酮試劑4.0mL，沸水浴中加熱10min，用流水冷卻至室溫，在620nm 處測其吸光值。

由圖6、圖7 可以看出，上下相體積之比R 隨PEG6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而增大，總體變化幅度不明顯，分配系數(shù)K 及收率Y 呈遞增趨勢。但PEG6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于15.7%時(shí)，上相黏度較大，不利于提取，原因應(yīng)為上相PEG6000 濃度過大。

圖6 分配系數(shù)K 及上下相之比R 與PEG6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系

圖7 收率Y 與PEG6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

3.2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)因素與水平見表4。對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，見表5。

表4 正交試驗(yàn)因素水平

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，因素A、B、C 對試驗(yàn)結(jié)果均有影響，從極差可知，影響作用主次順序?yàn)锳 ＞C ＞B，試驗(yàn)最佳組合為A2B2C2，即PEG 相對分子質(zhì)量為6 000、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.6%、PEG6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.7%。

3.2.5 試驗(yàn)結(jié)果分析

在PEG 相對分子質(zhì)量為6 000，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.6%，PEG6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.7%條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，所得多糖在上相中的收率為57%，收率大大提高，可將其視為雙水相萃取芡實(shí)多糖的最佳組合條件。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)PEG 相對分子質(zhì)量為6 000、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.6%、PEG6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.7%時(shí)，芡實(shí)多糖在上相中的收率最大，分配系數(shù)最高，綜合考慮可將其視為最佳萃取條件。此時(shí)若能考慮其它物質(zhì)如蛋白質(zhì)在雙水相中的分配規(guī)律，更能利于芡實(shí)成分的后續(xù)純化工作。由于芡實(shí)粉末過細(xì)及試驗(yàn)條件有限，多糖提取液制取過程中多糖損失過多，因而應(yīng)在該方面改進(jìn)加工方法。

［1］陳叢瑾，等.雙水相萃取法分離純化黃酮類化合物的研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用化工，2005，39(10):1587-1589.

［2］周曉云，傅美景.雙水相體系提取脂肪酶的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，23(2):205-210.

［3］霍清，等.利用雙水相乙醇—磷酸氫二鉀體系萃取甘草有效成分的研究［J］.精細(xì)化工，2002，19(2):65-67.

［4］謝云飛，等.用雙水相體系分離血紅蛋白(HB)［J］.2010，36(5):685-689.

［5］劉楊，王雪青.雙水相萃取法富集分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究［J］.海洋科學(xué)，2008，7(32):30-32.

［6］江詠，李曉璽，李琳，等.雙水相技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(10):235-238.

［7］朱自強(qiáng)，關(guān)怡新，李勉.雙水相分配技術(shù)提取小分子物質(zhì)的進(jìn)展［J］.化工進(jìn)展，1996，4:29-32.

［8］張水華主編.食品分析［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2009.

［9］吳疆，班立桐.應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)提取雙孢菇多糖的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32(7):4-6.

［10］金婷，譚勝兵.水法提取普洱茶茶多糖條件優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(12):7382-7384.

［11］李容，等.綜合評分優(yōu)選白茅根總酚酸和總?cè)铺崛」に嚕跩］.食品研究與開發(fā)，2013，12:77-80.

［12］劉洋，等.木瓜蛋白酶輔助提取大蒜水溶性粗多糖的工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2013，10:26-29.

［13］秦微微，等.雙水相萃取米糠多糖工藝條件的探究［J］.中國調(diào)味品，2014，3:54-58.

［14］張強(qiáng)，等.山茱萸果核制備活性炭的工藝研究［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，11:146-152.